GJB2基因突变与NSHI患者临床表型的相关性研究进展*

杨晓林 综述 许政敏 审校

新生儿先天性听力损失是一种常见的出生缺陷。研究表明，新生儿听力损失发生率为0.1%～0.3%，重症监护病房的新生儿听力损失发生率可高达2%～4%[1]。据报道[2],超过50%的语前聋与遗传因素有关,在遗传性聋中,约70%为非综合征型聋(nonsyndromic hearing impairment, NSHI)， NSHI中属于常染色体隐性遗传的约占80%左右，常染色体显性遗传的约占15%～20%左右，而X连锁遗传以及线粒体遗传则各占1%左右。 迄今为止，已有140多个基因位点被认为与非综合征型聋有密切关系(http://webh01.ua.ac.be/hhh/)，其中GJB2基因是目前已知的最主要的致聋基因，约占50%以上[3～5]。

1 GJB2基因的结构和功能

编码缝隙连接蛋白26(connexin 26，CX26)的GJB2基因是1993年被克隆出来的, 1997年首次被发现其与NSHI有密切关系,定位于常染色体13q11-12，DNA全长为4 804 bp,由两个外显子组成[即一个简短的非编码外显子(exon1)和一个长的蛋白编码外显子(exon2),编码区主要存在于后者], 编码区为678 bp。其启动子区域由7个GC盒(即GGGCGG或CCGCCC分别位于DNA序列的-1 229,-746, -379,-313,-151,-93及-81位点)、两个GT盒,一个TTAAAA盒(位于DNA序列的-24位点)、一个NF-B结合位点、一个金属反应元件、一个乳腺因子结合位点及一个YY1样结合位点共同组成[6]。其编码的缝隙连接蛋白26以六聚体的形式在细胞缝隙连接处形成穿膜通道，这些通道是细胞间电解质、第二信使和代谢物质的重要通路，在信息传递和物质交换中起重要作用[7]。在内耳，GJB2基因主要表达在耳蜗的支持细胞、血管纹、基底细胞、螺旋隆凸、神经感觉上皮和耳蜗传导纤维[8～10]。目前认为CX26在钾离子从毛细胞到耳蜗内淋巴的再循环中起重要的作用。当毛细胞受到外界刺激后,钾离子经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液,缝隙连接蛋白通道在此过程中具有调控作用。GJB2基因突变包括移码突变、缺失、插入等，可产生有功能缺陷或无功能的Connexin26蛋白，在其蛋白翻译及通道蛋白聚集水平产生影响。Paola等[11]应用免疫荧光的方法(利用luciferyellow)研究Connexin26基因突变所产生的Connexin蛋白功能影响的过程中，发现部分突变可导致缝隙连接蛋白功能及Hela细胞连接功能的减退，影响细胞间的正常物质转运，从而阻碍了声信号向神经信号的转化。其影响至少存在于三个方面：①影响缝隙连接蛋白的聚集；②引起蛋白交通或标靶的缺陷；③产生结构完整但功能缺失的连接蛋白。因此，GJB2基因突变可以引起Connexin26蛋白正常结构的破坏，使上皮细胞间连接通道的完整性破坏以及通道开关的异常[11],使其传递信息的功能受阻或紊乱。而细胞外的离子浓度是毛细胞能量转换的基础,由于连接通道的异常,使钾离子回流进入内淋巴液的循环受到影响 ,浓度发生改变,导致Corti器钾中毒,从而引起感音神经性聋[12]。

2 GJB2基因突变的分子流行病学

近年来世界各国均对本国耳聋患者的GJB2基因进行了大规模调查研究。匈牙利耳聋患者中GJB2基因突变占遗传性隐性非综合征型聋的46%[13]，德国患者中占17%[14]，美国患者中占24.3%[15]，黎巴嫩患者中占33%[16]，奥地利患者中占45.8%～71.4%[17,18]，中国患者中占21%[19,20]，巴西患者中占11.5%～22%[21]，伊朗患者中占16.7%[22]，巴勒斯坦患者中占11 %[23]，希腊患者中占42．2 %[24]，印度患者中占17.7%[25]，以色列患者中占39 %[26]。各国的研究情况进一步说明，GJB2基因突变在导致遗传性非综合征型语前聋方面有着非常重要的意义，亟待开展对该基因的临床检测工作。

GJB2基因突变分为致病突变和多态性改变,致病突变是指人群中个体的 DNA分子结构发生改变，使基因的表达性状和功能发生改变，在单基因遗传病家系后代中，与遗传性状共同出现。多态性改变是指人群中个体的DNA 分子结构发生改变，但基因的表达性状及功能不改变,不与遗传性状共伴随。截止2008年10月9日已有219种以上的突变方式报道(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)，其中至少有111种突变明确可以引起NSHL(http://davinci.crg.es/deafness)，这给GJB2基因的分子诊断造成很大的困难,也是其临床表现差异很大的一个重要原因。另外尚有一部分突变形式如109G-A等是否引起耳聋还存在争议,需要进一步的大样本研究来证实。

GJB2基因的致病突变是遗传性非综合征型聋的主要致病原因，常见的突变热点有35delG、235delC、33-35insG、167delT等。近年的研究发现,这些突变热点存在明显的种族差异,比如:在地中海国家和美国遗传性非综合征型聋患者中35delG突变位点占总突变的60%～85%[27];犹太人中最常见的突变热点为167delT,约占53%,而35delG突变只占18%;中国和日本中最常见的的突变热点为235delC,分别占93%、73%[28,29],而35delG的发生频率却很低[30]。

GJB2常见的致病突变的分子学表现为：①35delG突变是其序列的第30～35位的6个G残基中缺失一个G残基，导致密码子序列移位产生终止密码子，使其翻译过程提前中止于13号密码子，形成含有12个氨基酸的小多肽而导致缝隙连接蛋白功能的异常[31]；②167delT是指编码区167处的T缺失造成移码突变，使终止密码提前到82位，最终形成含有81个氨基酸的多肽[31]；③235delC是指在编码区235处C缺失造成移码突变，使终止密码提前82位，最终形成含有81个氨基酸的多肽，比野生型蛋白的226个氨基酸截短了145个，且只有前 79个 氨基酸与野生型相同[32]。Connexin26蛋白分为5个区，即NT区、跨膜区(M1、M2、M3、M4)、细胞外区(E1、E2)、胞浆内连接区(CL)和CT区。235delC突变型 Cx-26多肽的M2区部分缺失，CL、M3、E2和M4区完全缺失，产生无功能的缝隙连接蛋白。此突变型蛋白可能丧失对缝隙连接通道pH值的调控，降低缝隙连接的通透性，导致听力下降。以上这几种常见的突变形式均可以称为截断突变,此类基因所合成的Connexin26几乎没有功能,可以引起相对来说更严重的临床表现。另外还发现有许多突变位点只是其中某个核苷酸的置换,结果影响了其中一氨基酸的性质,并未使合成的肽链的长度改变,使其所合成的Connexin26功能相对低下,此种形式可以称之为非截断突变。

多态性改变属于正常现象，绝大部分基因的多态性改变在1%左右。GJB2基因的多态性改变明显增高,目前已报道的约有42种(http://davinci.crg. es/deafness)，如G79A、T101C、C384T等，多态性改变单独出现均不引起疾病,但如此多无义突变的出现给GJB2基因的分子诊断带来了很大的麻烦。

3 GJB2基因诊断方法的研究进展

GJB2基因的编码区只有679 bp,且集中在一个外显子上，这使得对它的检测相对方便,然而由于其突变的多样性,突变位点的不确定性以及其在普通人群中比较低的发生率,目前尚难以形成一种经济、快速的方法进行大范围的筛查。传统的方法主要包括限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、限制酶切指纹—单链构象多态性分析(restriction endonucleases fingerprinting— single strand conformation polymorphism REF—SS—CP)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly— merase chain reaction—single strand conformation poly— morphism PCR—SSCP)、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)、变性高效液相色谱分析(denaturing high performance liquid chromatography，dHPLC)及直接测序(di—rectsequencing，DS)等[33～35]。其中比较适合于大样本筛查的方法之一是变性高效液相色谱分析(dHPLC)，该方法主要原理是基于不同片段的Tm值的差异对PCR扩增产物进行筛查，依据其峰形的不同进行初步筛查，对于有异常峰形的通过DNA测序进行确定。对于GJB2这种突变形式多样且片段短小集中的基因来说，此方法有很大的优势 ，是目前比较快速的基因筛查方式之一[34，35]。另外,基因芯片技术是近几年出现且不断完善的基因检测方法之一，针对GJB2在中国常见的几种突变形式, 王国建等[36]利用基因芯片技术进行了检测,证实了其具有快速、高通量、高准确性等特点, 显示出广阔的临床应用前景，然其费用高是其目前难以用于临床的主要原因之一，积极开发和完善新的基因检测芯片，使GJB2基因检测进入临床，是广大科研工作者面临的一个重要任务。

4 GJB2突变患者基因型与临床表型相关性研究现状

大量的临床研究显示[37～41],由GJB2基因突变导致的遗传性非综合征型聋在两侧对称性、始发年龄、听力损失程度、稳定性方面都具有多样性。GJB2 相关性耳聋一般为双耳同时受累,耳聋程度呈对称性,少数表现为不对称性,也有单耳受损报道;多数表现为出生即有的先天性聋,部分表现为婴幼儿期或青少年始发的后天性聋,但多为语前聋;其听力损失程度变异比较大，可由轻度到极重度，但多数为重度或极重度聋；听力图曲线主要为残余型、斜坡型和平坦型，极少为U型，但没有以低频下降为主的上升型曲线。通过耳声发射、听性脑干反应等电生理的研究提示，GJB2基因突变对耳蜗的损伤主要是在外毛细胞，与动物实验结果一致[42]。2006年Norris 等[43]报道了1994～2002年出生于亚利桑那州、爱达荷州、伊利诺州等州的9名有GJB2基因突变的患儿出生后均通过了新生儿听力筛查，然而在出生后12～60个月时被确诊为耳聋。2006年Waheeda[44]也报道了2例GJB2突变患者出现迟发性听力损失[41]。这些研究表明，并非所有的GJB2基因突变患者在出生时即已发生听力损失，在连接蛋白功能缺陷最终形成并对机体造成损害前,可能存在一个早期的窗口期,这对早期诊断带来了困难，也给治疗带来了新的希望[37]。另外Tomohiro等[45,46]在大规模的研究中发现，患者的听力学表现与发生在GJB2基因上的突变位点有很大的关系，截短突变(如235delC、35delG)比非截短突变(M34T、V37I、 L90P)引起的临床症状重，纯合的截短突变与一种截短突变合并一种非截短突变的复合杂合突变形式导致的临床症状更为严重。随着听力学检测技术和基因诊断技术的不断发展，对于GJB2基因突变和临床表现之间的关系的研究会不断深化。

5 结论和展望

近年来对GJB2基因及其与NSHI患者临床表型相关性的研究已经越来越深入,对GJB2基因的结构、Gonnexin26的结构和功能以及GJB2相关性耳聋患者临床表现分型的研究都有了很大的进展,确定的致病突变位点数在不断上升,发现了越来越多的分型和新的特点,这些研究成果为进一步诊断和干预先天性耳聋提供了新的机遇和挑战。目前,对于GJB2基因型和表现型的研究还主要是在横断面水平进行研究,对于早期的听力学状况以及动态的纵向研究少,一方面是由于病例分散，难以进行长期跟踪分析；另一方面在新生儿听力筛查和基因诊断没有广泛开展之前,难以对此类患者做出早期诊断,以致不能对GJB2基因突变患者听损伤的自然发病过程特别是早期的听力学情况有更深入的认识。 随着GJB2基因诊断技术的不断提高、全国新生儿听力筛查工作的广泛开展及对这一疾病的发生发展的进一步认识，有可能在更早的时间对此类疾病进行诊断和干预,为最终预防和治疗打好基础。如果在进行新生儿听力筛查的同时对GJB2基因进行筛查并对携带有此基因突变的人群进行前瞻性研究,以总结分析此类人群的听力学特点,进而有可能依据表型推出基因型，制定出更适合此类人群的诊断标准,以便能在疾病早期给于确诊和干预,最大限度的预防患者的听力下降。王秋菊等[47]已经在国内开展了GJB2基因检测在新生儿听力筛查中小样本的研究,但更大范围和更大规模的研究还有待于进一步的进行。

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