幽门螺杆菌细胞毒素相关基因致病岛及Ⅳ型分泌系统的研究进展

廖顺花，吴燕燕，王易

上海中医药大学免疫学与病原生物学教研室，上海 201203

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是定植于人胃黏膜的螺旋状微需氧革兰阴性菌，其感染与人类慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和胃淋巴瘤的发病相关。幽门螺杆菌致病物质包括尿素酶、鞭毛、菌毛以及2种外毒素——空泡毒素A(vacuolating cytotoxin A，VacA)、细胞毒素相关蛋白A(cytotoxin-associated protein A，CagA)，其中细胞毒素相关基因(cytotoxin-associated gene,cag)致病岛及其编码的Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system，T4SS)更引人关注。

1 幽门螺杆菌cag致病岛

1.1 致病岛

致病岛是细菌染色体上具有典型结构特征的基因簇，主要编码与细菌毒力相关的结构蛋白及代谢产物。其基本特征：20～100 kb的染色体基因簇；基因簇两侧一般具有重复序列和插入元件；基因簇通常位于细菌染色体的tRNA基因位点近侧，或与噬菌体整合有关的位点；基因簇DNA G+C mol%、密码使用与细菌染色体其他部分差异明显；基因簇编码产物多为分泌性蛋白及细胞表面蛋白，也可编码细菌的分泌系统、信息转导系统和调节系统。

根据G+C mol%的差异，致病岛分成高G+C致病岛和低G+C致病岛。幽门螺杆菌致病岛属低G+C类型[1]。根据致病岛DNA片段G+C mol%的明显差异及两侧具有的插入元件，推测幽门螺杆菌致病岛可能来自噬菌体或质粒，是基因转移的产物。

1.2 cag致病岛的结构特点

Censini等[2]在比较Ⅰ型(Vac阳性、CagA阳性)和Ⅱ型(Vac阴性、CagA阴性)幽门螺杆菌的遗传学差异时发现，Ⅰ型菌株含有一个大约40 kb的特殊DNA片段，具有致病岛的典型特征，定名为cag致病岛。其编码蛋白与已发现的其他细菌如根瘤农杆菌、百日咳杆菌、布鲁杆菌、空肠弯曲菌、嗜肺军团菌编码的Ⅳ型分泌系统蛋白高度同源，系毒素与毒素转运相关蛋白共同组成的分泌系统，故cag致病岛被认为是幽门螺杆菌重要的致病原。

cag致病岛含有30多个基因，序列非常保守，认为是通过水平转移方式来源于质粒或噬菌体。研究表明，只有具备完整cag致病岛的幽门螺杆菌菌株才有致病性，且被认为是幽门螺杆菌毒力增强的可靠标志。核酸序列分析显示，插入的序列IS605将cag致病岛分割为cagⅠ区和cagⅡ区，完整的cag致病岛结构应包含这2个区域。

以幽门螺杆菌26695菌株为例(已完成测序的标准菌株)，位于3′端cagW(5′-3′)之后，cagⅠ区共有16个基因，自3′端至5′端依次为cagA(5′-3′)、cagB(3′-5′)、cagC(3′-5′)、cagD(3′-5′)、cagE(3′-5′)、cagF(3′-5′)、cagG(3′-5′)、cagH(3′-5′)、cagI(3′-5′)、cagL(3′-5′)、cagN(5′-3′)、cagM(5′-3′)、cagO(3′-5′)、cagP(3′-5′)、cagQ(3′-5′)、cagR(5′-3′)。cagⅡ区共有14个基因，3′端为cagS(3′-5′)，其后依次为cagT/cag19(5′-3′)、cag18(5′-3′)、cag17(3′-5′)、cag16(3′-5′)、cag15(3′-5′)、cag14/13(3′-5′)、cag12(3′-5′)、cag11(3′-5′)、cag10(3′-5′)、cag9(5′-3′)、cag8(5′-3′)、cag7(5′-3′)、cag6(5′-3′)。其中cagⅠ区的cagF、cagE基因及cagⅡ区的cagT/cag19、cag15、cag12、cag11、cagS基因参与幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统的编码。未参与幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统编码的基因产物，大多属于功能未知蛋白。

1.3 cag致病岛的病理学意义

研究发现，cag致病岛中多数基因产物无直接致病作用，其间接致病作用与幽门螺杆菌的另一个重要毒力因子——VacA的产生、毒性作用形成及宿主细胞的炎症因子系统激活有关。

VacA是幽门螺杆菌的另一个重要毒力因子，由vacA基因编码，是一种分泌型蛋白毒素。VacA能改变细胞膜，形成跨膜离子通道，导致酸性水解酶释放，引起细胞肿胀，伴随包膜融合，最终使靶细胞发生空泡样变性。该毒素与感染者胃肠上皮细胞损伤和溃疡形成密切相关。流行病学研究显示，cag致病岛与VacA毒素的产生有关。有学者认为，cag致病岛的获得可促使vacA基因进化，其在幽门螺杆菌基因组中的整合是VacA活化的一个启动因素，因为vacA基因虽然存在于Ⅰ型和Ⅱ型菌株，但在Ⅱ型菌株中不表达或仅表达具有免疫反应性而无毒性的分子。Pahl等[3]提出这样一种假说，vac基因以一个前体分子存在，cag致病岛的遗传变化使其形成功能性基因，从而使感染的低毒菌株获得更多毒力因子。Atherton等[4]研究发现，CagA的表达与VacA的基因型存在一定联系，提示cag致病岛与vacA存在某种功能上的联系。cag致病岛编码的一种或几种蛋白质是否促进VacA的运输还有待进一步研究证实。但有文献显示，cag11编码产物的同源物在嗜水气单胞菌中作为Ⅱ型分泌系统的组成成分存在[5]。新近研究[6]发现，在作用机制上，CagA蛋白与VacA也存在相关性。CagA蛋白通过Ⅳ型分泌系统注入胃上皮细胞，与胃上皮紧密连接的支架蛋白(scaffold protein)ZO-1及跨膜蛋白结合分子形成复合物，在细菌附着处形成紧密连接元件的异位接合，并导致顶端接合的络合物组成和功能异常，使上皮细胞间的紧密连接打开，有利于VacA穿越上皮细胞屏障，进入胃黏膜下层，影响宿主免疫系统。

在幽门螺杆菌感染的炎症反应中，除CagA诱导的炎症因子表达外，cag致病岛编码的外膜蛋白大部分可激活核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)，以促进白细胞介素8(interleukin 8，IL-8)的表达。有研究发现，cag致病岛中的cagE、cagG、cagH、cagI、cagL、cagM为诱导IL-8在胃上皮细胞合成所必需，cagE产物在体内胃黏膜炎症反应中起重要作用。也有研究认为，cagE与cagA有协同作用，诱导胃黏膜上皮细胞产生IL-8的cagA阳性菌株其cagE也呈阳性。因此，有学者认为，作为cag致病岛存在的标志，cagE可能优于cagA。另有报道，幽门螺杆菌相关性胃炎患者IL-12水平明显增高，而肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)、IL-1β、IL-6等与炎症程度相关的细胞因子并没有明显变化。而IL-17 mRNA的翻译和蛋白表达水平在幽门螺杆菌感染者中较非感染者明显增高(IL-8在很大程度上受IL-17调节)[7]。

2 cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统

2.1 细菌分泌系统

细菌分泌系统是由多种效应蛋白组成的并连接革兰阴性细菌细胞内、外膜的一种跨膜转运装置，目前至少发现了5种类型(Ⅰ～Ⅴ型)。其中经周浆间隙分步转运的类型属两步分泌途径，有Ⅱ型和Ⅴ型分泌系统。而不经周浆间隙转运的类型为一步分泌途径，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系统。两步分泌途径的组成需要Sec蛋白家族参与，又称Sec依赖型分泌系统。一步分泌途径鲜见Sec蛋白家族参与，称Sec非依赖型分泌系统；而cag致病岛编码的分泌系统则为Sec依赖型的Ⅳ型分泌系统。

2.2 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统的结构组成

Tanaka等[8]在电子显微镜下观察到，cag致病岛阳性的幽门螺杆菌菌株有一细丝呈折叠状结构从细胞表面向外突出，而cag致病岛阴性菌株无此结构，提示幽门螺杆菌的Ⅳ型分泌系统由cag致病岛编码。

根瘤菌vib系统是公认的Ⅳ型分泌系统的研究原型。vib系统由3部分组成，即由具有ATP酶活性的VirB4、VirB11和VirD4组成的内膜结构，由VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10或VirB3组成的连接内、外膜核心的跨膜通道结构和由VirB2和VirB5组成的菌毛样外膜结构[9]。

cag致病岛编码的Ⅳ型分泌系统至少由16种蛋白组成，系连接细菌内、外膜的菌毛样大分子结构。与根瘤菌vib系统相似，也由3部分组成。 CagE、Cag6及Cag11(分别为VirB4、VirB11和VirD4的同源物)组成内膜结构；CagE具有ATPase活性并为转运底物提供能量；Cag11作为一种衔接蛋白起耦联作用，并为CagA转运所必需；CagW、Cag8、Cag7、 CagT(分别是VirB6、VirB8、VirB10、VirB11的同源物)及CagM、CagI、CagG、CagF 8种成分组成核心跨膜通道，其中CagT-CagX由CagM介导，于外膜形成CagX-CagM-CagT复合物[10]。CagT作为N端Sec信号序列，是细菌脂蛋白的典型信号序列，具有稳定自身和其他蛋白的作用。Tanaka等用免疫金电子显微镜检测发现，细菌表面的丝状结构与Ⅳ型分泌系统的主要成分cagT和cagX相关[8]。有研究者用激光共聚焦扫描电子显微镜和免疫场致发射扫描电子显微镜技术发现，幽门螺杆菌的cagT定位于细菌外膜上，分布在细菌表面纤毛样结构的基底部，推测其可能是分泌素或是与分泌素相关的脂蛋白，允许Cag14/13和针样纤毛结构通过，并起稳固其他蛋白的作用[8]。Cag7是Ⅳ型分泌系统表面丝状结构的主要成分，保护Ⅳ型分泌系统免遭胃黏膜中的胃酸侵袭。在慢性感染中，诱导抗原变异而使CagA逃避抗原抗体反应，诱导IL-8 产生而稳定装置表面其他成分。也有研究认为，Cag7可能是作为一种连接内、外膜的信号转导蛋白。CagF在CagA转运过程早期起类似分子伴侣样的作用，是CagA转运所必需的重要蛋白[11]。幽门螺杆菌的菌毛样外膜结构尚不清楚，未鉴定出与根瘤菌VirB2和VirB5具有同源性的蛋白。但有研究表明，CagT、CagX、CagY与幽门螺杆菌胞外菌毛样结构相关，这3种成分是根瘤菌核心装置成分的同源物。也有研究发现，CagC与根瘤菌菌毛结构中的重要成分VirB2在序列及结构上有一定的相似，其突变株可引起IL-8减少，同时也丧失转运CagA的功能[12]，但幽门螺杆菌的胞外结构也有可能与根瘤菌Ⅳ型分泌系统的菌毛结构完全不同。

此外，CagM、CagI、CagG、CagF对幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统也具有重要作用，尤其是对CagA的转运，但都与经典的vib系统无同源性，也许可将它们视为Ⅳ型分泌系统分泌装置的新成员[13]。

2.3 幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统的作用机制

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统对真核细胞信号的干扰作用主要是通过cag致病岛编码的疏水性毒素蛋白CagA来实现的。CagA相对分子质量为(120～145)×103，N端相对保守，C端变异较大。体外实验研究显示，CagA具有类似真核细胞信号转导通路中接头蛋白(adaptor protein)的作用，产生与真核细胞Gab家族接头蛋白类似的生物学作用(与Gab无同源性)。虽然CagA是目前唯一确定的由幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统转运至宿主细胞的毒素蛋白。但Franke等研究发现，除CagA外，Ⅳ型分泌系统可能还转运其他蛋白，促使宿主细胞内C-Met磷酸化，继而激活基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2)和MMP-9信号转导通路而促进细胞增殖[14]。

CagA由Ⅳ型分泌系统注入真核细胞后，直接进入宿主细胞的信号转导通路，经Src激酶酪氨酸磷酸化作用，易位的CagA与含SH2的蛋白质酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing phosphotyrosine phosphatase 2，SHP-2)形成络合物，活化下游信号转导分子，导致细胞骨架重排，使细胞形态呈蜂鸟样改变[15]；同时促进细胞增殖，表现出生长因子样效应[16]。CagA也可与Grb2结合，经Ras/MEK/ERK MAPK途径，使细胞蜂鸟样改变，并促进细胞增殖[17]。近期研究表明，虽然CagA阳性幽门螺杆菌诱导IL-8表达的能力远远大于CagA阴性菌株，但是剔除CagA并不影响NF-κB、MAPK的激活和IL-8的生成，提示CagA阳性幽门螺杆菌引发的IL-8生成尚有其他调控因素。但Selbach等研究[18]发现，所有接触依赖Ⅳ型运载体复合物的virB样基因敲除株及缺失整个cag致病岛的突变株不能分泌IL-8，认为细菌刺激IL-8分泌的能力很大程度上与其易位CagA的能力有关。插入及缺失突变研究显示，cag致病岛及其所编码的Ⅳ型分泌系统通过介导CagA与真核细胞的连接可激活核转录因子如NF-κB表达，致细胞表面形状改变及基垫结构形成，并激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等转录因子，经ERK/MAPK级联反应引起c-fos、c-jun原癌基因活化[19,20]。

3 结语

决定幽门螺杆菌致病性的cag致病岛及其所编码的Ⅳ型分泌系统将成为一个重要的药物靶标，如果Ⅳ型分泌系统能被封闭或表达受到抑制，就可使致病的幽门螺杆菌回归为正常的消化道菌群，以收“改邪归正”之功效。

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