结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展

王静娴，杨春

重庆医科大学病原生物学教研室/神经科学研究中心，重庆400016

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。近年来，结核病疫情严重，位居单一病原引起患者死亡的严重传染病之首。目前全球结核感染者约占总人口的1/3，每年有930多万人发展为活动性结核病，并有180多万人死于该病[1]。大多数情况下，只有少数结核分枝杆菌感染者发展为活动性肺结核病；绝大多数感染者属无症状和无传染性的，即潜伏性结核感染。巨噬细胞是机体防御系统的第1道屏障，一方面发挥着抵抗结核分枝杆菌的作用，另一方面又是结核分枝杆菌体内滞留、造成潜伏感染的主要场所。巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用对结核病的发生、发展、预后起着非常重要的作用，因此探讨两者的相互作用机制对结核病的防治尤为重要。本文就近年来该领域的研究进展作一综述。

1 结核分枝杆菌对巨噬细胞的免疫逃逸机制

感染结核分枝杆菌后，只有少数感染者发展为活动性肺结核病，大多数为潜伏性结核感染。结核分枝杆菌通过多种机制逃避和对抗巨噬细胞的抗菌作用。

1.1 通过调节细胞信号传递以及改变摄取方式和代谢途径逃避杀伤

结核分枝杆菌激活磷酸酪氨酸磷脂酶，表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类的抗原呈递分子下调，使细胞信号传递受阻，呈递巨噬细胞抗原的能力下降。结核分枝杆菌通过甘露糖受体(mannose receptor，MR)途径被巨噬细胞摄取，阻断补体受体介导的Ca2+信号通路，使之不能触发巨噬细胞的杀菌效应，反而促进结核分枝杆菌在吞噬溶酶体内的存活[2]。当结核分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后，其乙醛酸代谢途径关键酶——异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，ICL)表达水平明显上升。结核分枝杆菌可能通过乙醛酸循环支路途径的代谢逃避巨噬细胞的杀伤[3]。

此外，结核分枝杆菌胞壁上有一种贯穿胞质膜到细菌表面的不均一的高分子脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)成分，其末端带有甘露糖残基，作为MR介导结核分枝杆菌内吞。LAM被转送至巨噬细胞膜，插入糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)丰富区，改变巨噬细胞的多种功能，有利于细菌的存活。LAM及结核分枝杆菌分泌的一些糖脂具有高效氧自由基清除作用，可抑制巨噬细胞呼吸爆发对结核分枝杆菌的杀伤[4]。

1.2 阻止吞噬溶酶体的融合

吞噬体吞入异物后，与内质体发生一系列融合和分离，这是一个膜表面蛋白与内质体的质膜循环进程[5]。一系列因子如载体、铁清除分子、脂质合成分子涉及该过程，这些因子改变吞噬体融合和转运可能是干扰结核分枝杆菌生存的主要策略之一[6-10]。研究显示，结核分枝杆菌的某些菌体蛋白如早期分泌型抗原靶6/培养滤液蛋白10(early secretory antigenic target 6/culture filtrate protein 10，ESAT 6/CFP10/MTSA 10)和分泌型ATP1/2(secretion ATPase 1/2，SecA1/2)蛋白能阻断液泡ATP酶和GTP酶积累，降低pH值，干扰吞噬体的成熟和功能[7,8]。结核分枝杆菌吞噬体含MHCⅡ类分子、转铁蛋白受体等大量早期内体分子标记，而溶酶体膜糖蛋白、CD63、cAMP-1、溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP 2)及Rab7(rabex-7，属Rab蛋白家族)等晚期内体和溶酶体分子标记却相当少，说明巨噬细胞中的结核分枝杆菌吞噬体可与早期内质体融合，而与晚期内质体的融合受抑制，吞噬体的成熟受阻[9]。改变吞噬体的酸化对结核分枝杆菌的胞内存活也有一定作用，而结核分枝杆菌能在巨噬细胞中存活、增殖说明含有结核分枝杆菌的吞噬体酸化发生异常。早期研究发现，结核分枝杆菌可选择性外排质子-ATP酶，阻止吞噬体酸化，抑制Rab7产生，进而阻止吞噬溶酶体形成。结核分枝杆菌菌体富含脂质，如海藻糖霉菌酸酯可干扰细胞膜转运、MHC分子表面呈递，一定程度上反应性氮中间产物(reactive nitrogen intermediate，RNI)也被阻断，所以活化的巨噬细胞对结核分枝杆菌介导的抑制效应不敏感[10-14]。

吞噬体中的结核分枝杆菌可分泌Ser/Thr蛋白激酶G(serine/threonine protein kinase G，PknG)，其存在也阻碍吞噬体与溶酶体的融合[7]。它有3个区即N端(Trx)、激酶和C端四联重复肽重复区( tetratricopeptide repeat region，TPR)。Trx区缺失严重影响PknG活性，Thr63是活体内PknG磷酸化的唯一场所。宿主内PknG介导的结核分枝杆菌存活中，Trx基序和Thr 63残基具有各自的重要性[15]。另外，巨噬细胞内结核分枝杆菌可借助空泡出芽而离开吞噬溶酶体，使液泡不能成熟，阻断吞噬小体膜上液泡ATP依赖性质子泵的功能而逃避杀伤作用。近来研究表明，从结核分枝杆菌中分离的脂阿拉伯甘露聚糖衍生物——甘露糖化的脂阿拉伯甘露聚糖(mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM)与MR相互作用而延迟吞噬溶酶体的融合消化。研究发现糖肽脂(glycopeptidolipid，GPL)与ManLAM一样，通过MR调节吞噬溶酶体融合。GPL延迟吞噬溶酶体融合的能力依赖于巨噬细胞MR的表达[16]。

1.3 抵抗巨噬细胞氧依赖性杀菌系统的杀伤

氧依赖性杀菌系统包括反应性氧中间物(reactive oxygen intermediate, ROI)和RNI作用系统，它们是病原微生物入侵巨噬细胞的重要介质之一，感染后巨噬细胞内ROI和RNI水平均显著上升。结核分枝杆菌虽可避免溶酶体的杀伤，但活化的巨噬细胞可发生呼吸爆发，产生大量代谢性自由基，通过强氧化作用和细胞毒作用杀伤病原微生物。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶及组氨酸等氧自由基清除剂并不能改变巨噬细胞内结核分枝杆菌生长的受抑现象，说明结核分枝杆菌对巨噬细胞产生的ROI具有高度耐受性。RNI系统中产生的胍氨酸和一氧化氮(nitric oxide, NO)，对入侵的结核分枝杆菌有杀伤和细胞毒作用。随后的研究发现，在Mn2+存在时结核分枝杆菌产生的过氧化氢酶-过氧化物酶因具有过氧化物酶活性、细胞色素P450样的加氧酶活性及过氧亚硝酸酶活性，可有效抵抗ROI及RNI对结核分枝杆菌的杀伤作用[17]。

1.4 减少巨噬细胞的凋亡

诱导自身凋亡是巨噬细胞杀灭病原微生物、限制其在体内播散的重要机制之一，但结核分枝杆菌毒力株能通过某些机制抑制巨噬细胞凋亡，从而维持其在巨噬细胞内的存活。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)是介导结核分枝杆菌感染后巨噬细胞凋亡的关键分子之一。结核分枝杆菌毒力株诱导产生的可溶性TNF受体2(soluble TNF receptor type 2，sTNF R2)参与对巨噬细胞凋亡的抑制，主要通过诱导sTNF R2释放，降低Fas表达，阻断诱导凋亡的通路，从而限制感染的巨噬细胞凋亡。此外，结核分枝杆菌还可刺激多种免疫细胞释放白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)，使sTNF R2释放增加，从而阻断TNF α的激活作用[14]。跨膜蛋白Bc1-2被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一，通过控制细胞核内、外物质运输，抑制Ca2+释放或阻断细胞内过氧化物堆积而发挥抗凋亡作用。结核分枝杆菌可能通过上调凋亡抑制因子Mcl-1(属Bcl-2家族)的表达抑制巨噬细胞的凋亡。

1.5 降低巨噬细胞对刺激应答的敏感性

结核分枝杆菌感染早期诱导产生的大量γ干扰素(interferon γ，IFN γ)具有重要的抗结核及调节机体抗结核免疫反应的作用，能激活巨噬细胞吞噬和杀伤能力，增强抗原呈递功能。研究发现，细胞因子信号转导抑制因子降低巨噬细胞对IFN γ刺激的敏感性，导致巨噬细胞不能被充分活化[18]。LAM对巨噬细胞的凋亡产生影响，不仅改变IFN γ受体结构，使巨噬细胞对IFN γ的应答降低，还改变巨噬细胞表面标记，抑制巨噬细胞向CD4+T细胞呈递抗原的能力，使巨噬细胞对IFN γ的敏感性降低。

结核分枝杆菌能被多个Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)识别。TLR是属于IL-l受体家族的一种跨膜蛋白，其中TLR2更重要。结核分枝杆菌细胞壁上的19 kD脂蛋白能被TLR2识别，持续刺激巨噬细胞能降低IFN γ水平，减少抗原呈递和MHCⅡ类分子的表达。ESAT 6可通过TLR2产生类似影响[19]。TLR2/4也曾被认为在结核分枝杆菌炎症反应中起至关重要的作用[20]。但持续刺激TLR，机体会产生负调控，抑制过强的炎症反应，如出现内毒素耐受等。结核分枝杆菌在机体内能长期存在可能就是通过这种负调控机制抑制IFN γ，降低适应性免疫应答而产生逃逸。TLR干扰IFN γ释放似乎是一个潜在的致病机制[21]。MTSA 10是结核分枝杆菌RD-1区的一种特异性分泌蛋白(位于Rv3874开放读码框架区)，能调节巨噬细胞对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的应答并抑制巨噬细胞内LPS诱导的氧化剂产生。MTSA 10活化巨噬细胞的蛋白-酪氨酸磷酸酶(protein-tyrosine phosphatase，PTP)，活化的PTP能干扰晚期LPS信号，从而阻止巨噬细胞有效的免疫应答[22]。

2 巨噬细胞抗结核免疫机制

巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的场所，是机体获得特异性抗结核免疫力的第1步。巨噬细胞的活化能限制结核分枝杆菌的生长，甚至杀灭结核分枝杆菌，在结核病防御中起着至关重要的作用，是宿主控制结核分枝杆菌感染播散的重要防御屏障。

2.1 吞噬体与溶酶体融合

溶酶体对吞噬的病原微生物进行杀伤是巨噬细胞发挥抗感染功能的重要机制之一。在一定条件下，巨噬细胞可将含结核分枝杆菌的吞噬体传递至溶酶体，借助溶酶体酶杀伤结核分枝杆菌。吞噬溶酶体成熟障碍和吞噬作用受抑制对结核分枝杆菌在体内长期存活很关键，巨噬细胞在吞噬过程中，神经鞘氨醇激酶(sphingesine kinase)发挥类似Ca2+信号驱动器作用，促进吞噬溶酶体成熟。结核分枝杆菌可通过抑制神经鞘氨醇激酶来抑制吞噬溶酶体成熟[23]。对于溶酶体内物质获取吞噬泡而言，吞噬体表面的磷脂酰肌醇-3-磷酸盐(phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)是细胞膜上一种重要的调节运输脂类，表达有PI3P的结核分枝杆菌吞噬体可很快与溶酶体发生融合，活的结核分枝杆菌可抑制晚期溶酶体对吞噬泡的溶解作用，并通过水解PI3P抑制吞噬溶酶体成熟[18]。

2.2 分泌多种细胞因子发挥免疫调节作用

在结核分枝杆菌和其他细胞因子的刺激下，活化的巨噬细胞可通过分泌多种细胞因子，如IFN γ、TNF α、IL-1、IL-6、IL-l2、IL-18及转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF β)等[19]，发挥免疫调节作用。IFN γ是激活巨噬细胞抵抗细胞内病原体的最主要因子，可增加巨噬细胞清除结核分枝杆菌的活性，诱导Th0细胞向Thl细胞分化，活化更多的效应细胞和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)。TNF α可使很多免疫细胞游走并定位在结核分枝杆菌存在的部位，对包围感染部位、防止病原体扩散起重要作用。IL-1、IL-6促进T细胞、B细胞增殖活化；IL-12能诱导IFN γ而抑制IL-4产生，激活自然杀伤(natural killer，NK)细胞和T细胞；IL-12及IL-18能促进T细胞、NK细胞增殖和分化，并产生IFN γ，增强机体细胞免疫功能；TGF β是阻止过度炎症反应、减轻组织免疫病理损伤的细胞免疫抑制因子。

2.3 自由基对结核分枝杆菌的直接杀伤和诱导的细胞凋亡

研究发现，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后可产生大量的ROI和RNI。对多种结核病患者的活组织检查发现，结核性肉芽肿部位诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)浓度明显增高[24]。研究表明，巨噬细胞感染结核分枝杆菌后，可通过诱导自身凋亡对其进行清除。其中，多种促凋亡因子参与结核分枝杆菌感染诱导的巨噬细胞凋亡过程，如TNF α、Fas-FasL系统、Bcl及Caspase家族[25]。

2.4 结核分枝杆菌抗原的呈递

巨噬细胞是专职的抗原处理及呈递细胞。巨噬细胞在吞噬结核分枝杆菌后，可将其蛋白降解为具有免疫原性的小分子肽段。这些短肽片段的不同抗原表位可分别与MHCⅡ/Ⅰ类分子结合后呈递至巨噬细胞表面，分别激活CD8+和CD4+T细胞。T细胞通过表面TCR-CD3复合受体分子和CD4/CD8辅助受体分子与巨噬细胞表面相应抗原肽-MHCⅡ/Ⅰ类分子复合物结合后，可诱导T细胞产生活化的第一信号。在此基础上，巨噬细胞通过表面B7和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecular 1，ICAM 1)等黏附分子与T细胞表面CD28和淋巴细胞功能相关抗原1(lymphocyte functional antigen 1，LFA 1)等相应黏附分子结合，相互作用，产生T细胞活化的第二信号，随之产生结核分枝杆菌抗原特异性T细胞，促进机体对结核分枝杆菌的特异性杀伤和清除。活化的T细胞同时可分泌IFN γ、IL-12、TNF α等细胞因子，以进一步增强巨噬细胞的功能。

3 结语

结核分枝杆菌感染是严重威胁人类健康的疾病之一。结核分枝杆菌存在于受感染宿主的巨噬细胞中，潜伏感染时机体免疫反应与其处于动态平衡，巨噬细胞在维持这种平衡中起着重要作用。结核分枝杆菌与巨噬细胞可通过一系列机制发生复杂的相互作用。虽然目前发现了两者之间的一些关系，但由于存在非常复杂的作用机制，仍需进一步深入研究，以提高宿主巨噬细胞抗结核分枝杆菌的能力，这对结核病的防治有重要意义。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control—epidemiology, strategy, financing [R/OL]. World Health Organization Report 2009. WHO/HTM/TB/2009.411.http://www.who.int/tb/publications/global_report/2009/en/index.html.

[2] 朱友生，唐神结. 巨噬细胞在抗结核免疫中的作用及其研究进展[J].中国防痨杂志, 2004, 26(3):174-175.

[3] McKinney JD, Höner zu Bentrup K, Muoz-Elías EJ, Miczak A, Chen B, Chan WT, Swenson D, Sacchettini JC, Jacobs WR Jr, Russell DG. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase [J]. Nature, 2000, 406(6797): 735-738.

[4] Maciaszek JW, Parada NA, Cruikshank WW, Center DM, Kornfeld H, Viglianti GA. IL-16 represses HIV-1 promoter activity [J]. J Immunol, 1997, 158(1): 5-8.

[5] Pieters J, Gatfield J. Hijacking the host: survival of pathogenic Mycobacteria inside macrophages [J]. Trends Microbiol, 2002, 10(3): 142-l46.

[6] Connolly SF, Kusner DJ. The regulation of dendritic cell function by calcium-signaling and its inhibition by microbial pathogens [J]. Immunol Res, 2007, 39(1-3):115-127.

[7] Rohde K, Yates RM, Purdy GE, Russell DG. Mycobacterium tuberculosis and the environment within the phagosome [J]. Immunol Rev, 2007, 219: 37-54.

[8] Deretic V, Singh S, Master S, Harris J, Roberts E, Kyei G, Davis A, Haro S, Naylor J, Lee HH, Vergne I. Mycobacterium tuberculosis inhibition of phagolysosome biogenesis and autophagy as a host defence mechanism [J]. Cell Microbiol, 8(5):719-727.

[9] Steinberg BE, Grinstein S. Pathogen destruction versus intracellular survival: the role of lipids as phagosomal fate determinants [J]. J Clin Invest, 2008, 118(6):2002-2011.

[10] Kan-Sutton C, Jagannath C, Hunter RL Jr. Trehalose 6,6’-dimycolate on the surface of Mycobacterium tuberculosis modulates surface marker expression for antigen presentation and costimulation in murine macrophages [J]. Microbes Infect, 2009, 11(1):40-48.

[11] Hinchey J, Lee S, Jeon BY, Basaraba RJ, Venkataswamy MM, Chen B, Chan J, Braunstein M, Orme IM, Derrick SC, Morris SL, Jacobs WR Jr, Porcelli SA. Enhanced priming of adaptive immunity by a proapoptotic mutant of Mycobacterium tuberculosis [J]. J Clin Invest, 2007, 117(8):2279-2288.

[12] Hou JM, D’Lima NG, Rigel NW, Gibbons HS, McCann JR, Braunstein M, Teschke CM. ATPase activity of Mycobacterium tuberculosis SecA1 and SecA2 proteins and its importance for SecA2 function in macrophages [J]. J Bacteriol, 2008, 190(14): 4880-4887.

[13] Pieters J. Entry and survival of pathogenic Mycobacteria in macrophage [J]. Microbes Infect, 2001, 3(3): 249-255.

[14] Axelrod S, Oschkinat H, Enders J, Schlegel B, Brinkmann V, Kaufmann SH, Haas A, Schaible UE. Delay of phagosome maturation by a mycobacterial lipid is reversed by nitric oxide. Cell Microbiol, 2008, 10(7):1530-1545.

[15] Tiwari D, Singh RK, Goswami K, Verma SK, Prakash B, Nandicoori VK. Key residues in Mycobacterium tuberculosis protein kinase G play a role in regulating kinase activity and survival in the host [J]. J Biol Chem, 2009, 284(40): 27467-27479.

[16] Sweet L, Singh PP, Azad AK, Rajaram MV, Schlesinger LS, Schorey JS. Mannose receptor-dependent delay in phagosome maturation by Mycobacterium avium glycopeptidolipids [J]. Infect Immun, 2010, 78(1): 518-526.

[17] Imai K, Kurita-Ochiai T, Ochiai K. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin infection promotes SOCS induction and inhibits IFN-γ-stimulated JAK/STAT signaling in J774 macrophages [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2003, 39 (2): 173-180.

[18] Reiling N, Ehlers S, Hölscher C. MyDths and un-TOLLed truths: sensor, instructive and effector immunity to tuberculosis [J]. Immunol Lett, 2008, 116(1): 15-23.

[19] Basu SK, Kumar D, Ganquly N, Rao KV, Sharma P. Mycobacterium tuberculosis secreted antigen (MTSA-10) inhibits macrophage response to lipopolysaccharide by redox regulation of phosphatases [J]. Indian J Exp Biol, 2009, 47(6): 505-519.

[20] Jo EK, Yang CS, Choi CH, Harding CV. Intracellular signalling cascades regulating innate immune responses to Mycobacteria: branching out from Toll-like receptors [J]. Cell Microbiol, 2007, 9(5):1087-1098.

[21] Jang S, Uzelac A, Salgame P. Distinct chemokine and cytokine gene expression pattern of murine dendritic cells and macrophages in response to Mycobacterium tuberculosis infection [J]. J Leukoc Biol, 2008, 84(5): 1264-1270.

[22] Vergne I, Chua J, Lee HH, Lucas M, Belisle J, Deretic V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(11): 4033-4038.

[23] Kusner DJ. Mechanisms of mycobacterial persistence in tuberculosis [J]. Clin Immunol, 2005, 114(3): 239-247.

[24] Sureka K, Sanyal S, Basu J, Kundu M. Polyphosphate kinase 2: a modulator of nucleoside diphosphate kinase activity in mycobacteria [J]. Mol Microbiol, 2009, 74(5): 1187-1197.

[25] Bocchino M, Galati D, Sanduzzi A, Colizzi V, Brunetti E, Mancino G. Role of mycobacteria-induced monocyte/macrophage apoptosis in the pathogenesis of human tuberculosis [J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2005, 9(4): 375-383.