胚胎干细胞向内耳细胞诱导分化的研究进展*

李利 赵立东 综述 邢光前 杨仕明 审校

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)可在体外无限增殖，且保持其未分化状态，但在特定环境下可以被诱导分化为各种组织细胞。近年来，国内外众多学者致力于将ESCs诱导分化为内耳细胞并进一步治疗耳聋的研究。本文就目前ESCs特性、分化途径、方法以及相关的研究成果做一综述。

1 胚胎干细胞

ESCs是一个具有自我更新和多分化潜能的特定细胞群。在胚胎发育的早期(受精后5～7天)即囊胚期阶段，出现了两种不同的细胞类型：包绕在外形成囊腔壁的外胚滋养层细胞，将来发育形成胎盘；位于囊腔内的内细胞团，将来发育形成胚胎。内细胞团经体外培养就成为ESCs。1981年，Evans等从鼠的囊胚中分离出内细胞团，成功地建立了体外培养哺乳类ESCs的方法。ESCs的基本特征是：①分化潜能多，具有分化为机体任何组织细胞、器官的能力；②无限扩增的能力, 即理论上在体外条件适宜的情况下，通过有丝分裂无限扩增，长久和稳定地自我复制；③可以长期保持未分化状态。除此之外，ESCs还具有集落生成能力、正常的染色体核型等特征。ESCs的这些特征，使其成为人体器官功能丧失(特别是由于毛细胞缺失造成的耳聋)后替代治疗的理想选择。目前， ESCs已被用于帕金森[1,2]、脊髓损伤[3]、糖尿病[4]动物模型的治疗，另外还发现其可以分化为有功能的小鼠精子，与卵子结合后孵育出存活的子代小鼠[5]。

2 胚胎干细胞的分化

2.1ESCs的诱导分化 ESCs的多分化潜能使之可以在特定条件下被诱导分化为多种细胞。经典的诱导分化方法是模拟体内胚胎发育的过程，该方法必须先在体外将ESCs诱导成拟胚体(emryoid body, EB)，经悬浮培养和添加因子或基因促使其定向分化。1985年，Doetschman等通过在培养基中加入白血病抑制因子(LIF)，抑制ESCs分化，然后再去掉LIF，经悬浮培养使ESCs变成EB。EB是大球形的悬浮团，由内、中、外三个胚层组成。ESCs分化始于外胚层，在基因调控、蛋白表达方面与体内早期分化有许多相似之处，但是分化的精确时间存在差异[6]。目前，ESCs已经在体外被诱导分化为多种细胞，如造血细胞、多巴胺能神经元、心肌细胞、生殖细胞、肝细胞、神经细胞、胰岛细胞、内皮细胞和成骨细胞等。

Rolletschek等[7]用促生长因子IL-1B、脑源性神经生长因子(GDNF)、转化生长因子B3(TGF-B3)等作用，使ESCs分化成了TH阳性的多巴胺能神经元。Li等[8]将小鼠ESCs来源的EB转移到含ES终止液的组织培养皿中，经过贴壁，加入因子EGF、IGF-1、bFGF来进一步分化，最终得到表达毛细胞特异性标记物的细胞。上述研究中，虽然ESCs向不同细胞诱导时所加的因子不同，但是各种促分化因子都是在EB形成以后加入，各种促分化因子可能只能在胚体发育到一定阶段才能发挥作用。Yuasa等[9]通过在EB形成前加入信号拮抗因子(Noggin)预作用3天，结果EB形成后中胚层细胞增加，由ESCs分化形成的心肌细胞数目增加了100倍。也有实验证明，ESCs可以不经历EB阶段，而是以单克隆方式增殖分化，这种不经历EB阶段的培养方式，被认为仅仅适用在成分明确的培养基中，培养特定的细胞系，可以解决细胞纯化问题[10]。如果不加因子诱导，也不加LIF抑制分化过程，ESCs将会向什么方向发展呢？Hubner等[11]将小鼠ESCs培养在生殖细胞专用的无饲养层的培养基上，没有经过任何处理获得了卵子，提示ESCs向卵子的分化可能是自然发生的过程。

2.2ESCs分化的基因调节 ESCs分化的本质是基因表达发生了变化，当它向不同的组织细胞分化时会有不同基因组合的表达变化。所有ESCs都表达Oct4、Nanog和Sox2转录因子[12]，它们在维持ESCs自我复制和亚全能型中发挥重要作用。Oct4基因在ESCs中有丰富表达，ESCs分化一旦启动，其表达立刻下调。Sox2基因在未分化的ESCs中表达，而随着细胞分化而表达下调，也是内耳毛细胞形成的上游调节基因[13,14]。Nanog基因在未分化的ESCs中大量表达，而在分化的细胞中未发现。有实验证明，在维持ESCs自我更新的过程中，Nanog是与Oct4平行的另一条分子途径[15]。从Nanog基因持续表达的ESCs培养体系中撤除LIF后，ESCs形态无明显变化，Oct4基因表达水平维持正常。有关基因调控的细节问题及发挥作用的精确时间序列仍待进一步探索。

ESCs向不同组织细胞分化时也需要不同基因的参与。如Kim等[16]发现，转录因子Nurr1的作用可促进ESCs分化为有功能的多巴胺神经元，分化率达50%。Pitx3为调节中脑多巴胺能神经元生成和维持的关键转录因子，Zhao等[17]报道将Pitx3和绿荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染入小鼠ESCs中，并与PA6细胞共培养，产生了更多的多巴胺能神经元(91%)。Ying等[18]将绿色荧光蛋白敲进ESCs的Sox1区并用维甲酸促进其分化，结果ESCs分化为带绿色的神经祖细胞，同时表达Sox1。在利用cDNA阵点技术分析细胞分化基因的调控机制研究中，人们发现大约有1 000个基因参与到ESCs向神经前体细胞的分化过程。可以想象，如果利用转染或其他方法向干细胞中引入转录因子或引发干细胞定向分化的活性基因，有望实现ESCs的定向分化，高效率、高纯度地获得目的细胞。

3 ESCs向内耳细胞分化的体外研究

3.1ESCs向毛细胞分化的体外研究 传统观念认为，哺乳动物内耳发育成熟后毛细胞不可以再生。但是，近年来有关内耳毛细胞再生的研究取得了很大进展。Li等[8]通过体外适时加入表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、腺岛素样生长因子(insulin-like growth factor type I,IGF-1)等生长因子，从鼠ESCs逐步诱导分化为内耳祖细胞，最终获得表达毛细胞特异标记物的细胞——类毛细胞。徐运等[19]也用类似方法将小鼠ESCs在体外经过15～20天的诱导分化，发现分化的细胞约半数表达毛细胞特异性分子标记物。上述研究提示，鼠ESCs是有可能向内耳细胞诱导分化的。但是，这些细胞还只是结构上类似毛细胞，目前尚未证明其具有内耳感觉毛细胞的功能。

除生长因子外，ESCs向毛细胞的分化还需要特定基因的参与。Bermingham等[20]首次发现Math1基因在所有内耳感觉毛细胞中表达，其在上皮细胞向毛细胞分化和成熟中起重要作用，Math1基因缺陷小鼠胚胎不能产生内耳毛细胞。Zheng等[21]报道，过表达Math1的大鼠内耳组织经体外培养后，能使耳蜗柱状上皮细胞转变为毛细胞，以及促进椭圆囊支持细胞转变为前庭毛细胞，说明Math1能使出生后哺乳动物内耳保留产生新生毛细胞的能力。Gubbles等[22]将Atoh1基因(Math1同源基因)植入孕龄11天的胎鼠听囊，出生后的小鼠较正常小鼠多产生一排有功能的耳蜗毛细胞，提示Atoh1基因胚胎期的错误表达会使生后小鼠的耳蜗产生有功能的感觉细胞。Pou4f3即Brn3.1和Brn3c，在听毛细胞和前庭毛细胞中表达，对于耳蜗毛细胞和前庭毛细胞的产生和维持起着重要作用[23]，该基因变异可引起听毛细胞完全丧失及感觉神经元继发性损害，导致耳聋和平衡失调[24]。可见，Pou4f3对毛细胞的分化和存活是必须的[25]。Gfi1(growth factor independence 1)是Pou4f3下游的靶基因，其表达限于内耳感觉毛细胞和神经元，但目前尚不知Gfi1是否能被Pou4f3调节[26]。Gfi1变异可致动物行为异常、出生后耳蜗毛细胞缺如及对声音无反应[25]。Gfi1基因缺陷鼠毛细胞排列紊乱，外毛细胞无神经支配，表达一些非正常神经元标志物。Barh1基因在耳蜗和前庭毛细胞均有表达[27]，该基因变异导致内、外毛细胞变性和退化[28]，提示其参与毛细胞存活的维持。另有研究表明，Barh1基因在内耳的表达需要Math1基因的存在[29]。Math1、Pou4f3、Gfi1、Barh1基因均能促使内耳非感觉细胞转化成毛细胞，至于他们与毛细胞发育、功能维持之间的定量关系，目前知之甚少。内耳毛细胞发育相关基因的发现从不同的层面揭示听觉功能的分子奥秘[30]。

3.2ESCs向螺旋神经节细胞(SGNs)分化的体外研究 SGNs为听觉传入神经元，在哺乳动物，内耳毛细胞的损失可导致SGNs形态和功能改变，从而加重感音神经性聋。因此许多学者致力于研究能否用ESCs替代损伤的SGNs，从而恢复听觉或提高人工耳蜗植入后听力恢复效果。Coleman等[31]将小鼠ESCs与生后5天的大鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节在体外共培养，结果ESCs被分化为双极神经元细胞。2005年，Kim等[32]将小鼠ESCs诱导分化为神经祖细胞，并与新生小鼠前庭感觉上皮共培养，发现这些神经细胞向前庭毛细胞突触部位伸出突起，并有突触素(synaptophysin，一种38 kD的膜糖蛋白)表达，提示ESCs来源的神经祖细胞可以恢复外周前庭系统的神经连接。Matsumoto等[33]将小鼠ESCs体外诱导为神经细胞后，与出生后3天小鼠耳蜗基底膜共培养，7天后发现胚胎干细胞来源的神经细胞向毛细胞方向伸出突起，并表达神经突触标记物。最近Matsumoto等[33，34]又针对ESCs来源的神经细胞与耳蜗内毛细胞间形成突触情况进行了体外实验研究，他们将该ESCs与小鼠耳蜗感觉上皮共培养，7天后ESCs来源的神经细胞突起向内毛细胞方向生长，免疫组织化学方法分析该突触末端与内毛细胞相邻的部位表达synapsin1和synaptophysin。上述研究表明，ESCs不但可在特定环境下被诱导分化为SGNs，而且后者能与内外毛细胞形成突触连接。但是，这种连接是否具有信号传导功能尚需进一步探讨。

Glavaski-Joksimovic等[35，36]将胚胎干细胞胚体与包含有耳蜗核的脑干切片共培养，结果拟悬浮的拟胚体向耳蜗核方向贴壁生长，并分化为神经元、神经胶质细胞，而且表达神经突触小泡标志物。说明胚胎干细胞与脑干组织共培养，可以分化为神经细胞，并与脑干耳蜗核形成突触连接。

4 ESCs向内耳细胞分化的体内研究

4.1ESCs向毛细胞分化的体内研究 ESCs定向分化是内因和外因共同作用的结果，其中外因起着重要作用。有学者认为，哺乳动物内耳毛细胞损伤后无法再生的原因是成熟内耳的前体细胞数量较少[37]。为此，Li等[8]先将ESCs在体外经EGF、IGF-1、N2诱导分化为内耳前体细胞，再将前体细胞植入鸡胚听囊上皮，结果在耳蜗毛细胞层发育为表达毛细胞标记物MyosinⅦ的类毛细胞。该研究虽然并非在哺乳动物体内完成，但是为ESCs内耳植入治疗开辟了新的思路。Coleman等[38]将带有EGFP的小鼠来源ESCs通过圆窗直接注入鼓阶，检测部分分化的ESCs，发现带有EGFP荧光的ESCs可在鼓阶中存活4周时间，其中2周时数量最多。但是，国内外文献中至今尚无将ESCs导入哺乳动物内耳后分化为耳蜗感觉毛细胞的相关报道。

4.2ESCs向SGNs分化的体内研究 Lang等[39]将ESCs体外培养至能表达神经祖细胞标记物nestin后，再分别导入内、外淋巴和蜗螺旋管，发现，导入外淋巴和蜗螺旋管中的ESCs最易存活，尤以造模早期阶段(造模后1～3天)导入存活率最高，其中导入外淋巴中的ESCs 50%分化成神经胶质细胞，导入螺旋管者20%分化成神经胶质样细胞，仅4.5%分化为神经元细胞；相比之下，导入内淋巴的ESCs则存活极少，这可能与导入过程本身易引起内外淋巴液的混合和离子失衡有关。上述结果表明，ESCs内耳植入后的存活情况取决于内耳微环境，植入ESCs的存活、分化及潜在功能的发挥主要限于损伤早期阶段。

Corrales等[40]将携带EGFP的ESCs来源的神经祖细胞导入经oubain预处理后沙鼠(SGN被选择性损伤，而毛细胞完整)的耳蜗神经干，观察发现，导入3天后的细胞仍表达EGFP，并能被神经元特异性标记物tubulin(微管素,微管蛋白)标记；导入后12天，可见分化的神经元向Corti器生长；导入后64～98天，神经元胞体发出大量神经突起(表达β-III tubulin)，后者从蜗管发出，成簇地经骨螺旋板到达Corti器，并与失SGN支配的毛细胞建立突触连接。与未导入ESCs的模型动物比较，实验组动物在靠近感觉上皮区细胞分化明显，说明ESCs来源的神经元有向模型动物神经退化特定部位分化生长的特点。

纵观文献资料，现有的ESCs体内导入的作用靶点主要是变性的神经元，仅少数针对受损的耳蜗毛细胞[8]；导入方法与基因及其他细胞导入[41～43]基本一致，具体方法包括：经鼓阶打孔注射[44]、经圆窗膜注射[39]、中阶导入法[45]、经蜗轴注入耳蜗神经干[46]等；导入后细胞的存活时间大致在1～9周不等[44，46～48]。至于ESCs分化到什么阶段导入活体耳蜗最为合适，目前尚无一致意见，如：Coleman等[38]将ESCs经体外诱导分化至神经前体阶段，导入耳蜗鼓阶；Corrales等[40]将ESCs通过 F12等因子作用，分化成祖细胞阶段再导入耳蜗神经干；而Lang等[39]将ESCs体外培养至表达nestin阶段，分别通过圆窗膜导入鼓阶外淋巴、经耳蜗骨板导入蜗螺旋管(Rosenthal’s canal,RC)和经圆窗膜入鼓阶后再经基底膜导入中阶内淋巴中。但无论采取何种导入方法，都应尽力避免引起内、外淋巴液的混合，否则，可能会导致听力下降甚至全聋，导入的细胞也无法存活[39，40]。

5 结语

体内、外实验研究结果初步表明，ESCs内耳导入后具有被诱导分化为感觉毛细胞和神经元的潜能，但该方法最终是否可以用于感音神经性聋的临床治疗尚难以定论，许多问题有待进一步研究阐明，如： ESCs体外诱导至何种程度开始导入内耳最为合适？ESCs导入耳蜗后能否定位在Corti器的适当位置？ESCs导入后能否进一步分化为所需要的内耳细胞？能否有传入和传出神经的支配并恢复感知声信号的功能？如何解决ESCs来源问题引起的排斥反应、安全性问题以及所涉及的伦理问题？对这些问题的解答有赖于更多科学资料的积累。

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