喉移植免疫学研究进展

马瑞娜 综述 崔鹏程 审校

喉全切除后理想的重建方法是喉移植。早在1965年就有关于狗喉再植模型的研究。1969年，Klausken等对一位喉癌患者施行部分喉移植术，手术本身是成功的，患者术后在恢复发声、呼吸、吞咽功能的同时也取得了较好的美容效果，但术后8个月患者死于肿瘤复发。在随后的20年中由于技术和免疫排斥问题以及伦理学的争论，使喉移植的发展落后于其它实质性脏器的移植。近年来随着免疫生物学的发展及免疫抑制剂的研究，喉移植逐渐成为患者改善生活质量的迫切需求。1998年Strome等[1]完成了人类历史上第一例喉移植，该患者在随后7年多能正常吞咽，发声基本正常，颈部外观美容效果好，有较高的生活质量[2]。喉移植无论在发声、呼吸、美容、生活质量等方面均优于目前喉全切除后的其它重建方法。然而由于人喉黏膜不仅血运丰富,而且富含免疫组织及免疫细胞,移植后的排斥反应始终是一个难题。本文就喉移植免疫学方面的研究进展作一综述。

1 喉移植免疫调节

1.1喉的免疫原性 近年来对人[3～5]以及实验动物[6，7]的研究表明喉包含有免疫组织，这种组织以喉相关性淋巴上皮滤泡的形式存在，其表达与年龄和疾病相关，并呈弥散分布，这种免疫结构对外界环境的变化反应迅速。在对大鼠的研究中发现病毒、细菌及其诱导的变态反应均可引起这种免疫组织快速反应，导致树突状细胞大量增殖[8，9]。同种异体移植物存活的关键主要依赖于供体主要组织相容性抗原复合物(major histocompability complex，MHC)的表达，供体的淋巴细胞、树突状细胞等具有丰富的MHCⅠ、Ⅱ类抗原，是主要的致敏原，排斥反应发生的快慢和严重程度取决于供、受体组织相容性的匹配程度[10]。Rees等[5]通过免疫荧光技术检测人的喉黏膜，结果显示喉的上皮组织及黏膜含有MHC抗原，并认为喉黏膜具有免疫活性，可能会引起喉移植急性排斥反应。Edward等[11]研究发现人喉的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)在各种组织中分布不同，人喉的黏膜层高表达HLAI，中度表达HLAⅡ；黏膜下腺层高表达HLAⅡ，中度表达HLAI；甲状软骨和甲状腺中仅高表达HLAI；在软骨膜和雪旺细胞中均可见HLAI和HLAⅡ表达，但HLAI表达强于HLAⅡ；软骨基质、肌细胞、神经轴突既不表达HLAI也不表达HLAⅡ。MHCⅡ是启动免疫排斥的主要抗原，在喉组织中主要分布在黏膜上皮层、黏膜下腺、血管、软骨膜和雪旺细胞。根据淋巴细胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)及功能的不同将淋巴细胞分为若干亚群，在免疫排斥中，MHCI和 MHCⅡ抗原都需要CD4的参与，CD8在被活化前由CD8与CD4共同识别抗原递呈细胞表面的异体的MHC[12]，CD8+T细胞的T细胞受体/CD3复合物(TCR/CD3)识别外来抗原与MHCI类抗原(多肽部分)的复合物，介导细胞毒性T细胞对抗原进行排斥。 CD4+T细胞中的TCR/CD3识别外来抗原与MHCⅡ类抗原(多肽部分)的复合物，激活TH1和TH2细胞，使巨噬细胞和B细胞活化。树突状细胞是最重要的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有强烈的激活T细胞的能力，这些细胞分散在除了脑组织和角膜之外的全身各个组织中，是全身免疫系统的监视细胞，在移植后的排斥反应中具有重要作用。Jecker 等研究表明大鼠的APC 主要存在于喉黏膜上,这一结论在其他实验动物如猪的实验研究中也得到证实[7,13]。Friedman等[14]发现树突状细胞主要存在于上皮细胞中，喉上皮组织中树突状细胞的分布密度最高，上皮下层树突状细胞的密度仅为上皮层的25%。除了声门处密度较低以外，树突状细胞沿着喉气管下行，密度逐渐增高，软骨组织中没有树突状细胞的分布，喉的非黏膜组织与黏膜组织相比仅具有很低密度的树突状细胞，喉的黏膜组织是免疫排斥反应的靶细胞。在一些器官移植的实验中发现，组织缺血再灌注后会引起主要组织相容性抗原表达上调，从而会增加移植物的免疫原性[15]。Barker等[13]在对猪的喉移植模型的研究中发现声门上区缺血再灌注后免疫活性细胞数量减少，声门下区缺血再灌注后免疫活性细胞的数量明显增多。总之，在不同样本间免疫细胞活性的表达更取决于个体的差异性而不是以上所说的这些部位改变。因此，这种发现的生物学意义也受到了质疑。

1.2免疫排斥反应的分级和标志 Strome等[16]研究的喉移植模型不仅包括喉，还包括甲状腺、甲状旁腺等。早在1992年，他们对大鼠喉移植模型的研究发现喉急性免疫排斥反应一般开始于术后24小时，最早是黏膜水肿、白细胞渗出，接着是大量淋巴细胞渗出，进行性的上皮组织、腺体、肌肉以及骨骼破坏，14天后移植喉出现完全的破坏，最终被肉芽组织取代。Lorenz等[17]将大鼠喉移植后免疫排斥按照移植的时间和供体喉植入后不同组织的变化分为未见排斥(24小时内)、轻度排斥(3天)、中度排斥(5～7天)、中重度排斥(9～12天)、重度排斥(15～20天)5个等级。在对同种异体移植喉样本的各种组织结构进行分析后发现上皮组织的排斥反应最明显，移植后1周左右即有大部分复层上皮已经排斥得只剩单层上皮，而到15～20天时，已经检测不到上皮组织；肌肉组织是另一类免疫排斥较明显的组织，肌肉在移植后1周左右即已经排斥掉一半，而在15～20天时已完全缺失；小唾液腺在移植后1天即发生水肿，5～7天左右发生萎缩，而7～10天时已经完全被排斥掉；淋巴滤泡在移植后3天少有肿胀，5～7天时较明显，9～12天时体积变小；甲状腺在移植3天时已开始发生排斥反应，5～7天时已经被排斥掉一半以上，9～12天后已经完全被排斥掉；软骨膜的免疫排斥反应较以上组织弱，在9～12天时仍有大部分软骨膜存在，而15～20天时还有一半软骨膜存在；软骨的免疫原性是最弱的，在9～12天时未发生免疫排斥反应，软骨结构正常，15～20天时仅有少量软骨组织减少，大部分结构仍存在。Nelson等[18]将甲状旁腺素(parathyroid hormone ，PTH)作为免疫排斥的生物学标志，根据Strome等[16]研究的喉移植模型，在大鼠同种异体移植术前对受体实施甲状旁腺切除术，移植术后24小时发现受体体内甲状旁腺素重新达到标准化水平，并且随着免疫排斥的进行开始下降，甲状旁腺组织学的变化与移植喉组织免疫排斥反应组织学的变化相一致，因此认为，PTH可以作为喉移植急性排斥反应的生物学标志。陈刚等[19]在对大鼠喉移植的研究中发现移植组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白细胞介素10(interleukin 10, IL-10)表达水平的变化与排斥反应的密切程度相关，TNF-α是介导喉移植术后急性排斥反应的重要细胞因子；IL-10在喉移植免疫耐受中发挥重要的调节作用。TNF-α能有效地反映免疫排斥反应的程度，而IL-10则是反映免疫耐受的有效指标。TNF-α及IL-10能够反映移植组织排斥反应进程的变化。

2 降低免疫排斥的对策

理想的降低移植排斥措施是进行同基因型喉移植，在MHC配型吻合的人群中进行移植有诸多优越性，但寻找MHC配型吻合的供体较为困难，限制了其临床应用。常用的降低免疫排斥的措施有：应用免疫抑制剂，诱导受体免疫耐受，降低喉的免疫原性。

2.1免疫抑制剂的应用 限制喉移植临床应用的主要问题是免疫抑制剂的使用，寻求一种既能诱导免疫耐受同时副作用又小的免疫抑制剂是今后的发展方向之一。环胞素A(cyclosporin A，CsA)的应用开创了抑制排斥反应的新局面。由于CsA 有效地抑制了抗体和细胞介导的免疫反应及慢性炎症，已成为免疫抑制疗法的主要用药。Strome[16]通过应用CsA对大鼠同种异体喉移植的研究表明，CsA应用剂量与移植物的组织学变化成负相关。CsA用量小(5 mg-1·kg-1·d-1)时, 移植喉的组织学表现为中到重度排斥反应;CsA剂量为7.5 mg-1·kg-1·d-1时,组织学表现为轻到中度排斥反应;应用大剂量CsA(10 mg-1·kg-1·d-1)的组织学仅表现为炎性细胞浸润, 黏膜和黏膜下腺体结构形态基本正常,说明CsA有抑制喉同种异体移植免疫排斥反应的作用。CsA的主要副作用是肾毒性，类固醇能够减少环胞霉素A到2 mg/kg,在减少CsA用量的同时减小了CsA的副作用，而免疫抑制作用未受明显影响[20]。Berke等(1965)在对犬进行同种异体喉移植的实验中,将CsA、硫唑嘌呤、甲基强的松和强的松联合应用，证实可延长动物存活时间，声带功能恢复良好，组织学检查基本正常。Nelson等[21]将他可莫林单独或与麦考酚脂联用，发现麦考酚脂能够提高他可莫林的耐药性，同时减少他可莫林的剂量。Akst等[22]将他莫克林与抗T细胞α、β受体的单克隆抗体联用，持续5天，结果10例大鼠中有8例在术后的100天内在组织学上未出现强烈的免疫排斥，但是100天后，受体的免疫系统逐渐恢复，发生排斥反应。Khariwala等[23]在这种受体出现免疫恢复的时候，再次应用上述短期冲击疗法，取得了满意的效果。这种短期应用免疫抑制剂方法的好处在于避免了长期应用所产生的副作用。

2.2诱导移植物的免疫耐受 诱导嵌合体形成是最古老的诱导免疫耐受的方法。嵌合状态即两种来源不同的细胞群在一个机体内共同存在的状态，对移植物的长期存活具有重要意义。供体骨髓输注移植术已经被成功的应用于人的实质脏器移植以提高受体的嵌合状态。在大鼠喉移植中，Khariuala等[24]对移植术后静脉输注骨髓和在喉移植同时接受同一供体血管化骨移植这两种方法进行研究，虽然两种方法喉移植术后受体存活均可超过180天，但均未能检测到嵌合体，血管化骨移植组混合淋巴细胞检测并没有显示特殊的免疫耐受，嵌合状态小于1%。这种结果与实质脏器移植结果不同，可能是免疫抑制剂应用时间的限制尚未使受体外周血中形成供体细胞。虽然目前其他领域已有临床应用嵌合体诱导免疫耐受的经验,但仍需进一步研究其可行性及建立成熟的评价体系。

2.3降低移植喉的免疫原性 喉是由甲状软骨、环状软骨、杓状软骨、肌肉、黏膜和关节等构成的复合组织器官，具有很强的免疫原性，采用直接的同种异体移植术必然会引起强烈的免疫排斥反应，最终导致移植的失败，而大量使用免疫抑制剂会造成原有肿瘤复发或者转移，多重感染等严重后果(Lepold,1983)。 Barthel等[25]认为在移植前对供体喉进行7.34 Gy 左右的体外照射,可减少环孢素的用量,有一定的免疫抑制作用。但Lorenz等[20]认为对移植喉进行体外照射只是增加了受体对免疫抑制剂的摄取，并未降低移植物的免疫原性。也有学者认为移植前对受体进行预防性照射,可显著减少移植后的排斥反应[26]。通过组织工程技术获得异体的少量组织，在实验中经过灭菌、消化、分离、培养等可降低免疫排斥反应，如Yamashita等[27]利用聚丙烯网复合猪皮肤胶原基质,成功修补犬的半喉，Xu等[28]通过高渗盐、核酸酶消化及乙醇脱水处理后制备出牛声带细胞外基质，侯楠等[29]运用灌注法制备出了兔低免疫原性全喉支架，这种支架在保留了软骨活性的同时提供了较完整的去细胞全喉支架,但其应用于临床还需进一步的研究。

随着器官移植学的飞速发展，非生命必须器官的移植受到人们的重视，尽管喉移植的免疫抑制方法还有待进一步完善，但是随着该领域研究的不断深入，喉移植将成为人类治疗喉全切除术后喉功能重建的新选择。

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