灭幽汤对小鼠幽门螺杆菌感染性胃炎NF-κB表达的影响

王小娟，施花锦，郭建生，夏 历

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007）

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要致病因子，中医中药对H.pylori感染性胃炎的研究主要是临床疗效研究和体外抑菌研究，对其发病和作用机制研究较少。近年来有研究发现H.pylori感染与核因子-κB(NF-κB)有着密切的关系[1-2]，本实验通过建立H.pylori感染性胃炎的小鼠模型,观察中药复方灭幽汤的临床疗效,并重点研究该方治疗胃黏膜炎症的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级雄性昆明小鼠50只，体质量 （25±5）g，由湖南省长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，动物合格证号：SCXK(湘)2006-0001。

1.1.2 药物 灭幽汤（由黄芩、蒲公英、青皮、陈皮、三七、白及、乌贼骨组成）由湖南中医药大学第一附属医院中药房提供，将中药浸泡30 min后用武火煎煮3次，再将汤汁熬成浸膏，高温灭菌后保存备用。三九胃泰颗粒由三九医药股份有限公司生产,国药准字0904012。

1.1.3 试剂 快速尿素酶试剂盒由福建三强生物化工有限公司生产;免疫组化NF-κB一抗、二抗及SABC,购自武汉博士德生物有限公司。

1.1.4 仪器 石蜡切片机，调温定时型电烤箱，分光光度计，凝胶成像分析系统，4BH-Z型光学双筒显微镜，显微镜照相系统。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 昆明小鼠50只，适应性饲养1周后按体质量随机分组：正常对照组10只，造模组40只。根据预实验结果，用灌胃针灌50%的乙醇0.2 mL/只，1 h后灌胃给以H. pylori菌株(109CFU/mL，0.4 mL/只)；隔天灌胃1次，共5次,接种后第5天进行快速尿激酶检测，阳性者为造模成功[3]。将造模成功的小鼠按体质量随机分为4组：灭幽汤高剂量组、灭幽汤低剂量组、三九胃泰组、模型组，每组10只。

1.2.2 给药方法和剂量 灭幽汤高剂量和低剂量组分别为33.79 g/kg、11.26 g/kg灌服灭幽汤煎液（给药剂量均按60 kg成人体表面积换算，分别相当60 kg成人用量的4、2倍），正常组和模型组灌胃生理盐水15 mL/kg每日灌胃1次，连续用药2周。

1.2.3 H.pylori感染情况 快速尿素酶检测阳性可判断为H.pylori感染。

1.2.4 病理组织学检测 采用HE染色法观察小鼠胃黏膜炎症程度，炎症程度分级参照人胃炎的分类法，均属于慢性浅表性胃炎,根据炎细胞的数量及浸润胃壁的深度分为3级并计分：无炎症0分,轻度炎症1分,中度炎症2分,重度炎症3分。

1.2.5 NF-κB的蛋白表达 采用免疫组化法检测 （操作方法参考相关试剂盒说明书）。采用病理图像分析系统对免疫组化染色切片进行图像分析，每张切片随机选择10个视野，在高倍镜下计算其平均光密度（OD）求其平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 灭幽汤对小鼠胃黏膜炎症程度的影响

灭幽汤组H.pylori阳性率明显低于模型组及三九胃泰组,差异有统计学意义(P＜0.05)；灭幽汤组胃黏膜炎症程度低于模型组及三九胃泰组，差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表1。

表1 灭幽汤对各组小鼠胃黏膜炎症程度的影响 （n=10）

2.2 灭幽汤对小鼠胃黏膜 NF-κB的蛋白表达的影响

正常组、灭幽汤高、低剂量组、三九胃泰组与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；灭幽汤高、低剂量组与三九胃泰组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；三九胃泰组、灭幽汤高、低剂量组与正常组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见表2。

表2 灭幽汤对各组小鼠胃黏膜NF-κB蛋白表达的影响 （n=10，OD，±s）

表2 灭幽汤对各组小鼠胃黏膜NF-κB蛋白表达的影响 （n=10，OD，±s）

注：与模型组比较*P＜0.05；与三九胃泰组比较#P＜0.05；与正常组比较△P＞0.05。

组别正常组模型组三九胃泰组高剂量组低剂量组药物剂量（g/kg）——0.128 0.034 0.026 NF-κB 0.090±0.049* 0.272±0.091 0.170±0.051△* 0.112±0.090△*# 0.127±0.071△*#

3 讨论

近年研究发现,H.pylori是引起慢性胃炎、消化性溃疡和MALT淋巴瘤的主要病因,且被认为是胃癌的Ⅰ级致癌因子。H.pylori本身及其定植后所引起的炎症和免疫反应是H.pylori造成胃黏膜损害的主要机制,NF-κB是一种作用广泛的转录因子,通常以非活性状态存在于胞浆中。当细胞受到外界刺激时,从细胞质易位到细胞核,与特定基因启动区域上针对NF-κB的特定序列结合,调控特定基因如前炎症介质(如TNF-α,IL-1和IL-8)、黏附分子、趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)和IL-8和一些炎性相关酶类的过度或持续表达,使大量的炎性细胞浸润于炎症部位[4-5]。

清热利湿法不仅对H.pylori有直接抑杀作用,而且还能通过调整机体全身和胃黏膜局部的屏障功能,以达到辅助抑杀并改变H.pylori寄居的微环境,使之不利H.pylori定居或繁殖,以达到治疗H.pylori感染的目的[6]。灭幽汤是在中医基础理论指导下组方而成，以清热利湿，理气和胃立法，方中黄芩、蒲公英清热燥湿解毒为君，以除脾胃之湿热；青皮、陈皮行肝脾气滞以疏通气机；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陈皮协调气血之运行，又收敛生肌修复局部之病灶；重用乌贼骨制酸止痛而为之使。研究表明：清热解毒中药能够改善胃黏膜炎症细胞浸润，黄芩、蒲公英能抗多种病原微生物，对多种球菌和杆菌有杀灭作用；白及祛腐生肌可修复糜烂的胃黏膜；乌贼骨含有丰富碳酸盐和磷酸盐能改变胃的酸性内环境，抑制H.pylori的生长；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，促进血液循环消除组织水肿，促进黏膜增生，加快修复，临床研究显示本方对HAG患者具有较好的疗效。这些药物直接或间接的抗炎作用可能是本方改善胃黏膜炎症的基础。

实验结果显示,胃黏膜炎症部位存在组织学的异常，炎症细胞密度增加，NF-κB存在失活和活化两种状态，NF-κB活化表达与炎症细胞密度呈正相关,提示由NF-κB激发的黏膜炎症反应,可能是影响炎症程度的关键。而经灭幽汤治疗,胃黏膜炎症部位NF-κB表达、炎症细胞密度均显著减低,组织学改善,说明灭幽汤能抑制NF-κB的活化和表达,从而抑制炎症细胞的浸润。可见，灭幽汤能减轻胃黏膜炎症程度,降低NF-κB表达强度,说明灭幽汤可能通过调节机体免疫功能,增强胃黏膜屏障能力,抑制胃酸分泌,调节胃内微环境,抑制H.pylori定植；改善胃黏膜血流,抑制致炎因子的产生,从而起到减轻胃黏膜炎症,保护胃黏膜的作用;通过抑制H.pylori的定植,减少其产生的细胞毒素的刺激,减少炎症介质的产生,降低NF-κB高度表达,从而发挥对胃黏膜的保护作用。通过观察H.pylori感染性胃炎的小鼠模型发现,H.pylori感染后NF-κB的表达强度升高,抑杀H.pylori后可以有效的治疗幽门螺杆菌相关性胃炎，抑制NF-κB的激活可能是灭幽汤在幽门螺杆菌相关性胃炎的防治中发挥抗炎作用的机制之一。

[1]胡伏莲,周殿元.幽门螺杆菌感染的基础与临床[M].北京:中国科学出版社,2002:54.

[2]刘文忠.幽门螺杆菌研究进展[M].上海:上海科学技术文献出版社, 2001:66.

[3]张荣光，段广才.幽门螺杆菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中华医学杂志，2006，86（12）：857-859.

[4]单兆伟.幽门螺杆菌感染研究现状及中医药治疗展望[J].世界华人消化杂志,1998,6(7):553.

[5]徐 艺，叶 柏，单兆伟，等.中草药单味与复方对幽门螺杆菌抑菌作用研究[J].中国中西医结合脾胃杂志，2000，8（5）：292-293.

[6]戴高中.对中医药治疗幽门螺杆菌感染相关性胃肠病的思考[J].中医杂志，2005，46（5)323-325.