正交试验法优选知母水处理工艺

李习平，杨梓懿，石继连，江星明

（1.岳阳职业技术学院药学与检验系，湖南 岳阳 414000；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。具有清热泻火、生津润燥的功效，用于外感热病，高热烦渴，肺热燥咳，骨蒸潮热，内热消渴，肠燥便秘[1]。研究表明，芒果苷是其清热作用的主要有效成分[2]。为了保证知母的临床疗效，我们采用正交设计法，以芒果苷的含量为考察指标，对其水处理软化工艺进行了优选研究，为其饮片规范化、标准化生产提供科学依据。

1 实验材料

LC-10ATVP型高效液相色谱仪 （日本岛津）；N3000色谱软件系统；SPD-10AVP型UV检测器 （日本岛津）；FE102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱DHG101型 （巩义市英峪予华仪器厂）；ISO9001型分析天平（南京庚辰科学仪器有限公司）。

芒果苷对照品 （成都普思生物科技有限公司提供，批号：PS08062501）；知母药材购自湖南省邵东县廉桥中药材市场，经湖南中医药大学中药资源教研室周日宝教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 因素水平

以芒果苷为考察指标，选择加水量、浸泡温度、浸泡时间和润制时间等4个因素进行水处理工艺考察。各因素水平见表1。

表1 知母水处理软化工艺因素水平表

2.2 水处理方法

取知母药材，按L9（34）因素水平表，加一定量水，在一定的温度下，浸泡一定的时间捞出，再润制一定的时间后切制成厚度为2～4 mm的薄片，在80℃烘干。

2.3 芒果苷含量测定

2.3.1 色谱条件 Gemini5uC18110A 柱 （150 mm× 4.6 mm）；流动相：水∶乙腈∶0.85%磷酸（108∶18∶5）；流速：0.65 mL/min；柱温：30℃；检测波长：258 nm。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取一定量的芒果苷对照品，加甲醇制成0.177 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取经“2.2”项下方法制备的知母饮片，分别过30目筛后精密称取0.1 g，置50 mL具塞烧瓶中，加入50%乙醇25 mL，精密称定。90℃水浴回流30 min，冷却，用50%乙醇补重。滤过，精密量取续滤液5 mL，水浴挥干溶剂，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.4 标准曲线的建立 分别精密吸取芒果苷对照品溶液0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL，加甲醇定容至5 mL，在上述色谱条件下重复进样2次，每次20 μL，测定峰面积。以峰面积平均值（A）和浓度（C）进行线性回归，得回归方程为：

A=4 368 440 C+19 718，r=0.999 6

结果表明芒果苷在0.177～0.885 μg之间线性关系良好。见图1。

图1 芒果苷HPLC图

2.3.5 精密度试验 取对照品溶液，每次进样20 μL，连续进样6次，测定芒果苷吸收峰面积，计算RSD为1.82%。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、6、12、24 h进样，测定芒果苷吸收峰面积，计算RSD值为1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重现性试验 精密称取同一知母样品粉末0.1 g，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法平行制备5份，各进样两针，每次进样20 μL，测定芒果苷的吸收峰面积，计算RSD为1.93%。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一知母样品粉末0.05 g 6份，分别精密加入相当于样品中芒果苷含量80%、100%和120%的芒果苷对照品溶液，按供试品溶液处理，进行含量测定，计算芒果苷的平均回收率为（98.15±2.18）%，RSD为2.22%。结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

2.3.9 样品的含量测定 取不同水处理软化方法制备的供试品溶液，按上述色谱条件，进样20 μL，测定峰面积，以干燥品计算含量。结果见图2、表3。

图2 芒果苷供试品HPLC图

表3 知母水处理L9(34)正交试验结果 （n=3）

2.4 方差分析

以SS值最小的A因素SS值作误差，对正交设计实验芒果苷含量的结果进行方差分析，4个因素对芒果苷的含量均无显著性影响，经综合考虑实际情况，知母的最佳水处理软化工艺为A1B3C1D1，即将知母药材加 20倍水，在30℃下，浸泡时间0.5 h后捞出，润制时间4 h。结果见表4。

表4 方差分析表

3 结论

3.1 色谱条件的确定

检测波长258 nm是将芒果苷对照品溶液作全波长扫描及参考有关文献[3]后确定的。流动相和流速经多次预试后确定，理论塔板数大于3 000，拖尾因子为0.98，说明系统适应性良好。

3.2 因素水平

本实验选择考察加水量、浸泡温度、浸泡时间及润制时间等4个对水处理工艺影响较大的因素，经单因素考察初步结果，结合传统软化方法的实际操作，确定了每个因素的水平。从实验结果看来，各因素的考察水平有待于进一步细化。

3.3 芒果苷的提取方法

许多提取芒果苷的文献[3-4]多为超声提取，笔者曾用超声法在同一超声仪中提取制备供试品 （同时提取多个或多次分别提取），重现性和加样回收率试验结果RSD均大于5%，最后改用本实验中的回流提取补重的方法，RSD均小于3%。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2005：148.

[2]邓家刚，郑作文，曾春晖.芒果苷的药效学实验研究[J].中医药学刊，2000，20(6)：802.

[3]周永刚，黄 晟，谷 莉，等.HPLC法测定知母药材中芒果苷和新芒果苷的含量[J].药学实践杂志，2005，23(2)：99-102.

[4]宋 珅，陆兔林，季 德.正交法优选光知母水处理工艺[J].中药材，2007，30(3)：335-338.