鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞形态学的影响

赵蒙蒙，谢梦洲，李路丹，何军锋，王 玉

（1.湖南中医药大学2007级研究生班，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；3.山西特殊教育中等专业学校，山西 太原 030012）

鬼箭羽(Euonymus alatus)为卫矛科(celatraceae)卫矛属植物卫矛(Euonymus alatus（Thunb）Sicb)具翅状物的枝条或翅状附属物，是一味传统的中药[1-2]，其气微，味微苦涩，性寒，无毒，入厥阴、太阴经。具有破血、通经、杀虫、散瘀止痛等功效。药材中含槲皮素(Quercetin)、卫矛醇(Dulcito1)等黄酮成分和甾类物质[3]。近年来,临床和实验研究均表明鬼箭羽对糖尿病及其并发症有很好的治疗和预防作用，并有研究者认为其能刺激β细胞加强胰岛素的分泌[4]，本实验针对鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞的影响进行形态学观察，现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选择清洁级SD大鼠40只，雄性，体质量180～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物质量合格证编号:scxk(沪)2008-0016]。

1.1.2 药物 鬼箭羽生药购自湖南楚仁堂医药连锁经营有限责任公司。鬼箭羽生药饮片以水煎，常压加热挥发浓缩至3.0 g生药/mL浸膏待用。优降糖（格列苯脲）由天津太平洋制药有限公司生产(生产批号：090112)。

1.1.3 试剂 链脲佐菌素（由美国Sigma公司生产，批号：112K10)购自长沙科泰生物技术有限公司；小鼠insulin单克隆抗体 （武汉博士德生物工程有限公司提供,批号：0805）；即用型SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司提供，批号：09E02）。

1.1.4 仪器 血糖测试仪（超越JPS-5）、血糖试纸（批号：20100728）均由怡成生物电子技术有限公司提供；彩色图像采集系统由湖南中医药大学病理生理实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 先将40只大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白组7只，模型制备组33只。制备2型糖尿病模型。然后将成模大鼠随机分为模型组、鬼箭羽组和优降糖对照组。

1.2.2 模型制备及给药方法 空白组大鼠予普通饲料喂养，其余33只大鼠进行2型糖尿病模型制备[5]，予高脂饲料喂饲(高脂饲料配方如下：猪油10%，胆固醇1%，胆酸0.3%，基础饲料88.7%)，4周后，将大鼠禁食不禁水12 h，然后行腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，剂量：30 mg/kg体质量（STZ以0.1 mol/L、pH4.4的柠檬酸钠缓冲液配制）。空白对照组以等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。同时观察大鼠一般状况。第4天，对模型制备组大鼠禁食不禁水10 h，尾静脉采血测空腹血糖，以空腹血糖＞10.0 mmol/L者为2型糖尿病造模成功。再将这些成为2型糖尿病模型的大鼠随机分为模型组、鬼箭羽组和优降糖对照组，进行下一步实验。鬼箭羽组：给予鬼箭羽2.25 g生药/kg，优降糖对照组：给予优降糖0.85 mg/kg，模型组、空白对照组：给予等量生理盐水灌胃，给药剂量均按60 kg成人体表面积换算。给药容量10 mL/kg体质量，每日1次，连续给药4周。末次给药0.5 h后，所有大鼠禁食不禁水10 h，尾静脉取血测空腹血糖，腹主动脉采血后处死，留取胰腺组织，进行胰岛β细胞形态学观察 （HE染色，免疫组织化学染色）。

1.2.3 空腹血糖检测 禁食不禁水10 h后，尾静脉采血，按照血糖仪的说明进行操作。HE染色检测：胰腺组织常规石蜡切片，HE染色光镜下观察胰岛，岛内细胞数目，细胞的形态，细胞膜完整性，细胞核的大小形态。免疫组化检测：用免疫组化ABC法对已制备的胰腺组织石蜡切片进行染色。以小鼠insulin单克隆抗体为Ⅰ抗显示β细胞，显微镜观察，计算机图像分析系统分析胰岛素染色阳性细胞的阳性程度，胰岛素染色阳性细胞面积。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 造模后一般情况观察

注射STZ后，有1只大鼠在造模过程中死亡，经血糖检测，有3只大鼠未达到2型糖尿病模型标准。成模大鼠均出现不同程度多饮、多尿，体质量减轻，精神不振，捕捉时抵抗力减弱，体毛无光泽等异常。

2.2 鬼箭羽对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响

将大鼠禁食不禁水10 h后，测空腹血糖，结果显示，模型组、鬼箭羽组、优降糖组与空白组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.001），说明2型糖尿病模型成功。给药4周后，模型组、鬼箭羽组、优降糖组空腹血糖较给药前均有所下降，其中以优降糖组最为明显，但与空白组相比，血糖仍然偏高，其差异具有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）；模型组血糖与鬼箭羽组、优降糖组相比较，其差异具有显著统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1 鬼箭羽对各组大鼠给药前后血糖的影响 (mmol/L，±s)

表1 鬼箭羽对各组大鼠给药前后血糖的影响 (mmol/L，±s)

注：与空白组比较▲▲P＜0.001；与模型组比较◆P＜0.05,◆◆P＜0.01。

组 别 n 药物剂量 给药前血糖 给药后血糖7.60±0.57 18.62±4.75▲▲13.46±4.03▲▲◆11.87±3.72◆◆空白组模型组鬼箭羽组优降糖组6899——2.25 g/kg 0.85 mg/kg 7.53±0.47 19.93±4.39▲▲18.42±5.03▲▲18.70±4.52▲▲

2.3 鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞HE染色的影响

空白组，正常胰岛呈圆形，胰岛β细胞大小一致，核染色质清晰，胞浆界线清楚，淡染细胞颗粒，细胞呈索状排列；模型组的胰岛β细胞排列稀疏不均，大部分细胞核淡染，细胞形态不一，溶界消失，胞浆出现空泡，不清晰；鬼箭羽组胰岛β细胞形态、结构与空白对照组正常胰岛细胞比较，大致正常，胞浆略不均匀，核仁尚较清晰，细胞排列较均匀；优降糖组胰岛β细胞与正常组比较，细胞排列较稀疏不均，大部分细胞核淡染，溶界消失，胞浆出现空泡，较不清晰，但与模型组相比，细胞形态改变程度略低。见图1。

图1 鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞的影响光镜图（HE染色观察10×40）

2.4 鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞免疫组化的影响

大鼠胰岛内染色阳性、细胞浆着棕色颗粒者即为β细胞。染色阳性区域面积大小代表胰岛素表达量，如图2所示。图像分析采用Image-pro plus6.0系统。统计面积（area）、平均光密度（Density（mean））、累计光密度（IOD（sum））等形态学量化指标。可以看出，模型组中阳性染色表达最低，各项指标与空白组、鬼箭羽组、优降糖组比较差异均有统计学意义（P＜0.001）；与空白组比较，其阳性面积与鬼箭羽组、优降糖组差异有统计学意义（P＜0.05），空白组平均光密度、累计光密度与鬼箭羽组、优降糖组比较，差异无统计学意义；鬼箭羽组面积、平均光密度、累计光密度等指标与模型组比较，差异均有统计学意义 （P＜0.01），鬼箭羽组与空白组阳性面积比较，其差异具有统计学意义（P＜0.05），鬼箭羽组平均光密度、累计光密度与空白组相比，差异无统计学意义。结果见表2。

表2 鬼箭羽对各组大鼠免疫组化相关指标的影响 (±s)

表2 鬼箭羽对各组大鼠免疫组化相关指标的影响 (±s)

注：与空白组比较▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；与模型组比较★★P＜0.001；与优降糖组比较▼▼P＜0.01。

组别空白组模型组鬼箭羽组优降糖组IOD(sum)（×103）16.42±2.94 5.34±2.45▲▲13.29±3.63★★14.65±3.47★★n6899药物剂量10 mL/kg 10 mL/kg 2.25 g/kg 0.85 mg/kg Area 107.6±20.48 48.96±11.54▲▲▼▼89.74±16.41▲★★90.95±11.24▲★★Density(mean) 169.79±28.61 107.38±26.32▲▲151.82±34.96★★160.96±31.74★★

图2 鬼箭羽对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞的影响光镜图（免疫组化观察10×40）

3 讨论

鬼箭羽性味苦寒，中医认为苦寒能坚阴清热，且能入血，鬼箭羽擅于清解阴分之燥热，对糖尿病之阴虚燥热者颇为有效。有研究表明鬼箭羽中提取的草酰乙酸钠通过刺激β细胞分泌胰岛素,降低正常和糖尿病家兔的血糖[1],临床实践亦表明其对于糖尿病具有良好的治疗作用[6-7]。本实验结果表明，鬼箭羽能够降低2型糖尿病大鼠的血糖，但其降糖效果不及优降糖；但是，病理切片进行HE染色后，对大鼠胰岛及胰岛β细胞形态学进行观察，鬼箭羽干预的大鼠胰岛及胰岛β细胞结构、形态与模型组相比，改变程度较低。从免疫组化的结果看，鬼箭羽干预的大鼠各指标都优于模型组，说明鬼箭羽可以起到保护和刺激胰岛β细胞的作用，优降糖组大鼠胰岛β细胞染色阳性程度也很高，是由于优降糖能够刺激胰岛β细胞，增加胰岛素的分泌，故而染色阳性程度高。综合HE染色及免疫组化观察到的形态学改变，研究发现鬼箭羽在降低血糖的同时，对胰岛β细胞具有一定的保护作用。

[1]赵国平,戴 慎,陈仁寿,等.中药大辞典[M].上海:上海科技出版社，2006：1 695-1 696.

[2]谢宗万,佘友琴.全国中草药名鉴[M].北京:人民卫生出版社，2000：538.

[3]彭学著.鬼箭羽研究现状考[J].湖南中医药导报,2003,9（12）：54-55.

[4]胡剑秋,甄 艳.参芪麦味地黄汤重加鬼箭羽治疗糖尿病[J].中国民族民间医药杂志,2000，5(45):209-210.

[5]陈 秋，夏永鹏，邱宗荫.2型糖尿病大鼠模型的建立与评价[J].天津医药,2006,1(34)：33-35.

[6]夏卫军,程海波,张 莉.鬼箭羽治疗2型糖尿病实验研究[J].陕西中医,2001,22(8)：505-507.

[7]尚文斌,程海波,唐含艳.鬼箭羽对糖尿病小鼠血糖及全血黏度的影响[J].南京中医药大学学报(自然科学版),2000,16(3):166-167.