3－氧十二烷酰高丝氨酸内酯对淋巴细胞Toll样受体2和4的影响*

芦 起， 余加林， 杨锡强， 刘 伟

(重庆医科大学附属儿童医院，重庆400015)

铜绿假单胞菌是医院感染中最常见的机会致病菌。它常引起急性和慢性肺部感染，多见于局部或全身免疫功能障碍的患者。现代微生物学观点认为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)感染大多以生物膜形式存在［1］。PA内各个细胞间的交流有赖于群体感应系统(quorum－sensing，QS系统)。QS系统不仅在调节铜绿假单胞菌生物膜形成上，而且在免疫调节上均有关键作用［2］。Toll样受体(Toll－like receptor，TLR)是一组重要的免疫模式识别受体，TLR信号转导在启动机体的固有免疫反应、介导获得性免疫反应中起到重要作用。本研究探讨QS系统信号分子对外周血淋巴细胞增殖、TLR 2、TLR4表达，及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis－α，TNF－α)分泌的影响。

材料和方法

1主要试剂

3－氧十二烷酰高丝氨酸内酯(3－oxo－C12－homoserine lactone，3－O－C12－HSL)购自Cayman公司，R/MINI－1640培养基和小牛血清购自杭州四季青生物制品公司。MTT和 DMSO购自Sigma，淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司。RNA提取试剂盒购自北京Biotake公司，逆转录－聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)试剂盒和DNA marker购自大连宝生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，CD3单克隆抗体、人TNF－α试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。

2 外周血淋巴细胞的分离和分组

取健康献血者外周静脉血40 mL，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，PBS充分洗涤，用含10%小牛血清RPMI－1640培养液调整细胞数为1×1010cells/L，采用12孔塑料培养板，随机分成5组。分别加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL各10 μL，在37℃、5%CO2培养箱中培养12 h。吸取上层淋巴液。经CD3单克隆荧光抗体染色后用流式细胞仪检测，证实所得的细胞85%以上为CD3+淋巴细胞。

3 TLR 2和4 mRNA的表达检测

按Trizo1说明书抽提总RNA。以oligod T为引物将提取的总RNA反转录，然后采用25 μL反应体系，运用PCR方法对TLR2和4及内参照β－actin同时进行PCR扩增。引物序列:TLR2:正义链5'－ggacttctcccatttccgtct－3，反义链5'－ctccaggtaggtcttggtgttc－3，产物138 bp;TLR4:正义链5'－ctgtccctgaaccctatgaact－3，反义链5'－cttctaaaccagccagaccttg－3’，产物135 bp;β－actin正义链5'－ccacgaaactaccttcaactcc－3，反义链5'－gtgatctccttctgcatcctgt－3'，产物131 bp。扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离(电泳条件:100 V，20 min)，溴化乙啶(5 mg/L)紫外灯下照相，用图像分析系统分析计算吸光度值(A)，表达的相对量用目的基因/β－actin A值表示。

4 MTT法测定

淋巴细胞悬液置于96孔微量细胞培养板中，每孔加入7×l09cells/L细胞100 μL，随机分成5组。同时分别加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL 1 μL，各设6个重复孔，另设培养液空白对照孔，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养12 h，加入20 μL MTT(5 g/L)。37℃继续培养6 h，加入150 μL DMSO低速振荡10 min。用酶联仪测定波长490 nm A值。

5 ELISA法检测TNF－α

将加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL加入1×1010cells/L外周血单个核细胞，培养12 h后，收集培养上清，14 000 r/min离心10 min，保存于－80℃冰箱中。用人TNF－α试剂盒按其说明书进行操作。

6 统计学处理

结果

1 不同剂量3－O－C12－HSL对CD3+淋巴细胞TLR2/4 mRNA的表达

未处理组TLR2/4 mRNA表达最低，随着3－O－C12－HSL剂量的加大，单核细胞TLR 2/4 mRNA逐渐增高，仅TLR4 mRNA未处理组和1 μmol/L比较P>0.05，余组间比较P<0.05，差异显著，见图1、表1。

Figure 1.TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h.Lane 1:3－O－C12－HSL 0 μmol/L; Lane 2:1 μmol/L;Lane 3:10 μmol/L;Lane 4:50 μmol/L;Lane 5:100 μmol/L.图1 不同浓度3－O－C12－HSL刺激后CD3+淋巴细胞TLR2/4 mRNA的表达

表1 不同浓度3－O－C12－HSL刺激后淋巴细胞TLR2/4 mRNATable 1 .Comparison of TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h(±s.n=3)

表1 不同浓度3－O－C12－HSL刺激后淋巴细胞TLR2/4 mRNATable 1 .Comparison of TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h(±s.n=3)

△P<0.05 vs 0 μmol/L 3－O－C12－HSL;#P<0.05 TLR2 mRNA at same dose of 3－O－C12－HSL.

?

2 不同剂量3－O－C12－HSL对CD3+淋巴细胞活力的影响

淋巴细胞的活力与未处理组比较增高，P<0.05，差异显著。100 μmol/L 3－O－C12－HSL促进细胞增殖的作用最明显，见表2。

表2 不同浓度3－O－C12－HSL刺激淋巴细胞MTT比色结果Table 2 .Comparison of MTT results in 3－O－C12－HSL－stimulated lymphocytes(±s.n=4)

表2 不同浓度3－O－C12－HSL刺激淋巴细胞MTT比色结果Table 2 .Comparison of MTT results in 3－O－C12－HSL－stimulated lymphocytes(±s.n=4)

△P<0.05 vs 0 μmol/L 3－O－C12－HSL.

?

3 不同剂量3－O－C12－HSL对TNF－α分泌的影响

不同剂量3－O－C12－HSL作用于外周血单个核细胞12 h后，在0 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 3－O－C12－HSL浓度组，单个核细胞TNF－α分别为719.968±5.732、593.256 ±25.040、490.649 ±9.654、367.137±15.386、267.090±13.878。与0 μmol/L组相比，其余各剂量组均可抑制外周血单个核细胞上清中的TNF－α的表达(P<0.05)，差异显著。100 μmol/L组3－O－C12－HSL抑制TNF－α分泌作用最明显，见图2。

Figure 2.Effect of 3－O－C12－HSL on production of TNF－α in mononuclear cells.±s.n=3.*P<0.05 vs 3－O－C12－HSL.图2 不同浓度3－O－C12－HSL抑制单个核细胞TNF－α的分泌

讨论

PA主要产生2种QS系统信号分子:3－氧十二烷酰高丝氨酸内酯［N－(3－oxododecanoyl)－L－homoserine lactone，3－O－C12－HSL］和N－丁酰基高丝氨酸内酯［N－butyryl－L－homoserine lactone，C4－HSL］。QS系统信号分子具有调节宿主免疫反应的作用。研究发现:lasI基因或lasI rhlI双基因缺失的铜绿假单胞菌不能在C57BL/6鼠肺部形成感染模型［3］。QS系统缺陷铜绿假单胞菌与相对应的野生型比较诱导HCE细胞产生IL－8能力降低［4］。3－O－C12－HSL能够诱导巨噬细胞的细胞毒性导致凋亡［7］。将3－OC12－HSL直接注射到小鼠皮肤里，其可通过NF－κB通路导致某些细胞因子的分泌，检测发现皮肤组织中的IL－1、IL－6、MIP－2、MIP－1 mRNAs表达增高［5］。

TLRs是一组与固有免疫密切相关的受体家族［6］。可介导固有免疫应答的产生和细胞因子的分泌［7］。TLR 2、TLR4在非特异性免疫中可广泛识别配体，在识别危险信号并诱发机体免疫反应中具有重要作用。感染后细胞TLR2和TLR4表达上调，并可诱导合成一系列炎性介质，是机体免疫系统对感染的一种防御反应，清除外来病原菌。目前对于抗原呈递细胞上TLRs研究较透彻，而淋巴细胞上的TLRs研究较少，多集中在调节性T细胞上。研究表明，TLR2可以引起调节性T细胞(T regulate cell，Treg)增殖，但同时Treg抑制活性发生了一过性消除;随着TLR2配体的清除，Treg抑制活性可以完全恢复。离体实验显示，细菌产物可以直接作用于Treg的TLR4，增强Treg的抑制活性［8，9］。

本研究结果表明，不同浓度的3－O－C12－HSL刺激单个核细胞后，淋巴细胞TLR 2、TLR4表达几乎均上调，TLR2亚家族的上调较TLR4为明显，提示TLR 2、TLR4上调不仅仅是增殖的结果，3－O－C12－HSL可影响淋巴细胞TLR 2、TLR4的不同表达，其原因可能为TLR 2、TLR4对3－O－C12－HSL的刺激有着明显的差异，TLR 2对3－O－C12－HSL更易感。其次RT－PCR检测存在一定误差，可通过实时定量PCR进一步证实。此外，3－O－C12－HSL能诱导淋巴细胞的增殖，与Hooi等［10］报道的QS系统可以通过抑制T细胞的增殖，扰乱免疫调节活动的结果不一致，这可能与Hooi等［10］直接用3－O－C12－HSL刺激淋巴细胞，而本研究是用3－O－C12－HSL刺激单个核细胞后，然后收集淋巴细胞有关，其原因可能为3－O－C12－HSL刺激单核细胞后，其分泌的细胞因子影响淋巴细胞TLR 2、TLR4表达有关。本研究发现TNF－α表达是随着3－O－C12－HSL增高而降低，而Kim等［11］发现CD4+CD25+Foxp3－或CD8+T细胞能够抑制不同固有免疫细胞的细胞因子的释放。因此，我们推测淋巴细胞的TLR 2、TLR4表达抑制了TNF－α表达，获得性免疫对固有免疫有反馈作用。至于是哪种(CD4+或CD8+)淋巴细胞亚型的增高，以及该亚群淋巴细胞的增高，对细胞内信号转导的影响，尚不清楚，还需进一步深入研究和探讨。

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