重组大鼠TSH α亚基在大肠杆菌中表达的实验研究

陈 猛，熊蔚俐，孙 蓓，梁东春，郭 刚，张镜宇

（天津医科大学内分泌研究所，天津市激素与发育重点实验室，天津 300070）

促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone, TSH）是垂体前叶嗜碱细胞合成、分泌的糖蛋白激素，由α链和β链两个亚基组成。若以大鼠为实验动物来研究甲状腺疾病，TSH的测定是必不可少的。特别是选用大鼠制作甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退的动物模型时，必须通过检测血清中甲状腺激素和TSH的含量来证实动物模型的建立是否成功[1-3]。检测大鼠血清中TSH不能采用临床上用于人TSH定量检测的试剂盒，此类试剂盒采用的是针对人TSH的抗体，若用于检测大鼠TSH则很可能造成结果的不准确。但是，国内市场一直缺少专门针对大鼠TSH的抗体或测定试剂盒。本实验通过构建大鼠TSHα链的原核表达系统及表达产物的提纯工作，成功获得重组GST-rrTSHα蛋白。鉴于此前本室已成功克隆并表达了rrTSHβ[4]，至此已具备了开发大鼠TSH定量检测试剂盒的必备基础。另一方面，也为体外合成完整的大鼠TSH分子创造了条件，而大鼠TSH是在用大鼠作为实验动物建立甲亢动物模型时所必要的。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌菌株 E.coli JM109、E.coli DH5α，质粒pGEX-3X为本室保存；pGEM-T Easy载体购自Promega公司。限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶、核酸分子量标志物DL2000，中分子量蛋白标志物购自TAKARA公司。兔抗GST抗体及Purification Module纯化试剂盒为美国Pharmacia公司产品。HRP标记的山羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠TSHα cDNA的克隆 提取正常Wistar大鼠垂体组织总RNA,RT-PCR扩增大鼠TSHα的cDNA序列。引物采用Generunner软件设计，序列如下：上游5′GGGGATCCCTTCTCACACCAG3′，下游5′GGGAATTCCTCAGGGTCCCACT3′；扩增产物大小为363bp。5′端3′端分别引入限制性内切酶BamH I及EcoR I识别位点。将目的DNA T-A克隆入pGEMT Easy载体进行DNA序列分析,由北京三博远志公司完成。

1.2.2 pGEX-3X/TSHα重组表达质粒的构建 将重组好的pGEM-T Easy/TSHα载体和pGEX-3X载体分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切处理，琼脂糖凝胶电泳回收所需目的条带。利用T4DNA连接酶构建融合表达载体pGEX-3X/TSHα，并将其转化至宿主菌E.coliJM109，挑单一菌落用EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切筛选出重组质粒进行DNA序列分析，予以确证。DNA测序由北京三博远志公司完成。

1.2.3 重组大鼠TSHα在E.coliDH5α中的表达 将重组质粒pGEX-3X/TSHα转化至宿主菌E.coliDH5α,接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，270r/min震荡培养16h，次日按1∶100比例接种于3ml新鲜的LB液体培养液中，振摇至OD600为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，270r/min诱导6h。设立无IPTG诱导的对照，同时以pGEX-3X空质粒转化/未转化的菌株作为对照。离心收集菌体经PBS清洗后，冰浴下超声碎菌，离心分别收集上清和沉淀行SDS-PAGE鉴定。

1.2.4 目的蛋白的大量表达和表达条件纯化 通过改变诱导剂的浓度，诱导时间以及诱导温度来选择最佳诱导条件。在最佳条件下大量诱导表达目的蛋白，冰浴下超声破碎菌体，离心收集包涵体。包涵体经浓度梯度升高的尿素溶液洗涤后溶于8mol/L的尿素溶液中，对浓度梯度降低的尿素溶液透析复性。利用GST Purification Module试剂盒亲和层析纯化融合蛋白，按操作说明书完成。

1.2.5 Western Blot鉴定融合蛋白 纯化后的融合蛋白行SDS-PAGE后将凝胶中的蛋白样本转移至硝酸纤维素膜上，用适量的封闭液（5%脱脂奶粉溶于含0.3%Tween20的PBS中），室温震荡1～2h后4℃放置过夜。以wash buffer(含0.3%Tween20的PBS)清洗NC膜3次后将其置入一软塑袋中，充分浸泡于1:500倍稀释的兔抗GST抗体PBS溶液中，室温震摇1h。以wash buffer清洗NC膜3次，浸于1:1000倍稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体PBS溶液中，室温震摇1h。取出NC膜，以wash buffer清洗3次，DAB显色液显色。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增TSHα cDNA PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期的363bp位置上出现特异的DNA条带，见图1。

2.2 重组质粒的酶切鉴定 如图2,用限制性内切酶EcoRⅠ/BamHⅠ酶切重组质粒pGEX-3X/TSHα，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期的363bp位置上出现DNA条带，大于2000bp的条带是酶切后的载体骨架。

2.3 表达产物的SDS-PAGE 所表达的融合蛋白N端带有约26kD大小的GST标签。推算GST-rrTSHα的分子量为38kD左右。由图3表达产物的SDS-PAGE可见，重组质粒pGEX-3X/rTSHα转化DH5α后经诱导表达,于碎菌后的沉淀中出现与预期大小相符38kD的蛋白条带。

2.4 诱导表达条件的优化

2.4.1 诱导时间的选择 以E.coli DH5α为宿主细胞，37℃，IPTG终浓度为 1mmol/L，诱导表达rrTSHα。诱导后4h即有融合蛋白表达可被PAGE检测到。随诱导时间延长，表达量逐渐提高，诱导12h达到高峰，此后随时间延长而降低。

2.4.2 诱导剂浓度的选择 以E.coli DH5α为宿主菌，37℃诱导表达rrTSHα，诱导时间均为12h。0.5mmol/L IPTG浓度时包涵体中融合蛋白含量达到高峰。

2.4.3 诱导温度的选择 以E.coli DH5α为宿主菌，IPTG终浓度取0.5mmol/L，于20～37.5℃，2.5℃间隔诱导表达rrTSHα。25℃诱导表达12h后，包涵体中融合蛋白表达量达到高峰。

2.5 亲和层析纯化GST-rrTSHα SDS-PAGE电泳在预期的38kD左右位置上出现GST-rrTSHα特异带，见图4。

2.6 Western Blotting鉴定纯化后融合蛋白 经Western Blotting鉴定，重组质粒pGEX-3X/TSHα转化菌的表达产物在38kD处确有一特异性的条带,见图5。

3 讨论

由于国内一直缺少专门针对大鼠TSH的抗体，本研究所构建成功的缺碘致甲低大鼠模型一直缺少血清TSH这一反映甲状腺功能的重要指标。本实验得到了重组大鼠TSHα链，和另一小组获得的重组大鼠TSHβ链可以作为免疫原免疫动物得到相应的抗体，用来特异性地检测大鼠体内的TSH水平，进一步证实甲亢或者甲低的动物模型建立的成功与否，具有广泛的实用意义。由结果可见，克隆入pGEX-3X质粒的大鼠TSHα编码序列，可以在大肠杆菌中获得有效的表达，表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中，经包涵体的复性、溶解及随后的亲和层析纯化可得到高纯度的重组蛋白。该蛋白在电泳中的行为与GST-rrTSHα的分子量相符，且可与抗GST抗体发生免疫反应。

通过基因工程方法表达重组融合蛋白作为免疫原是制备免疫原的另一种方法[5]，且以包涵体形式表达的蛋白不会影响我们制备高效价的抗体[6]。经包涵体洗涤后蛋白已达到较高纯度，在此基础上通过亲和层析可方便地从细菌裂解物中纯化蛋白，本研究中原核表达的融合蛋白产物经亲和层析纯化后纯度达到了92%，有利于制备高纯度的抗体。虽然以此重组蛋白做为免疫原制备的多克隆抗体会含有抗GST的组分，但GST标签的种属来源是日本血吸虫，针对此GST的抗体不会与哺乳动物体内的GST发生交叉反应。此外还可采用GST亲和层析柱以除去抗GST抗体组分[7]。综上所述，我们已完成了大鼠TSHα及β亚基的全部表达工作，下一步将制备两者针对性抗体用于大鼠TSH的测定。

［1］ Paschke R,Ludgate M.The thyrotropin receptor in thyroid disease [J].N Engl J Med,1997,337(23):1675

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［3］ Vassart G,Dumont JE.The thyrotropin receptor and the regulation of thyrocyte function and growth[J].Endocr Rev,1992,13(3):596

［4］ 马香书，马彦，孙蓓，等.大肠杆菌偏嗜性人促甲状腺激素β亚基编码DNA序列的克隆及表达[J].天津医药，2009，37(5):340

［5］ Yau KY,Lee H,Hall JC.Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies[J].Biotechnol Adv,2003,21(7):599

［6］ Kim YI,Ha YM,Nam YK,et al.Production of polyclonal antibody against recombinant ORF 112L of rock bream(Oplegnathus fasciatus)iridovirus (RBIV)and in vitro neutralization[J].J Environ Biol,2008,29(4):571

［7］ Wu C,Wang Y,Zou M,et al.Prokaryotic expression,purification, and production of polyclonal antibody against human polypeptide N-acetylgalacto-saminyltransferase 14[J].Protein Expr Purif, 2007,56(1):1