山东胶东地区规模鸡场三种主要病毒感染情况的调查

徐守振,尹燕博,郭艳艳

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109,2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛266101)

随着山东省养鸡业的持续发展,集约化程度的不断提高,鸡主要疾病的发生与流行也随之不断变化。有关资料表明,传染病仍是目前危害山东省家禽业的大敌,约占禽病发生总数的75%,尤其是禽流感(H9亚型)、新城疫(ND)和鸡传染性支气管炎(IB)等病毒性疾病仍然是危害山东省养鸡业发展的几种主要传染病[1]。近年来该几种病毒病呈现出非典型化、多重感染、混合感染和继发感染等特点,给禽病的诊断与防治工作带来很多困难。

为明确山东省禽流感(H9亚型)、新城疫(ND)和鸡传染性支气管炎(IB)的分布情况和流行特点,本试验用采用已建立的RT-PCR诊断技术对2009年下半年山东胶东主要养鸡地区(潍坊、青岛和烟台)等地送检的患有呼吸道症状的病料进行了3种病毒的感染情况调查,可为今后有效防制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2009年7月—2009年12月,收集送检的来自山东省三个主要养鸡地区(潍坊、青岛和烟台)规模化鸡场疑似患有呼吸道疾病的自然发病鸡病料,共计774份。

1.1.2 主要试剂 Tis-饱和酚氯仿为国产试剂;TaqDNA聚合酶、dNT Ps、DL 2 000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司;总RNA抽提试剂T rizol购自Invitrogen公司;M-MLV反转录酶购自Promega公司;RNase inhibitor购自Toyobo公司。

1.1.3 引物 根据GeBank已发表的序列,应用DNAstar和DNAman软件对NDV的F基因、IBV的S基因和AIV(H9)的HA基因序列进行同源性分析,应用Primer5.0和Oligo6.0软件对各自保守区设计引物,通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BlasT对其特异性鉴定表明3对引物均具有良好的特异性。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(见表1)。

表1 PCR引物T able 1 Primers for PCR

1.2 方法

1.2.1 病料的处理 将病料充分匀浆(与PBS 1∶5)后,反复冻融3次～4次,12 000 r/min离心15 min,取上清—20℃保存备用。

1.2.2 病毒总RNA的抽提 1.5 mL离心管内加入600 μ L T rizol裂解液,后加400 μ L病料,反复颠倒几次混匀。加入400 μ L氯仿,颠倒混匀,—20℃沉淀10 min。12 000 rpm离心10 min,取上清,再加入800 μ L异丙醇混匀,—20℃沉淀30 min。12 000 rpm离心10 min,弃上清,再加入750 mL/L冷酒精1000 μ L,冲洗1次～2次。晾干后,用无RNase水30 μ L溶解,—70℃冻存备用或即用。

1.2.3 cDNA的合成(RT) 病毒RNA反转录反应体系为20 μ L,其中RNA模板4 μ L,5×Buffer 4 μ L,dNTPs(10 mmol/L each)2 μ L,RNase Inhibitor(10 U/μ L)1 μ L,3种病毒基因序列特异的下游引物(25 pmol/μ L)各1 μ L,M-MLV(200 U/μ L)1 μ L,DEPC灭菌水7 μ L,轻轻吹打混匀,1 000 r/min离心1 min,在PCR仪上进行以下循环:42℃60 min,98℃5 min,反应后瞬间离心,反应产物置—20℃保存备用。

1.2.4 目的基因片段的PCR扩增 采用我们山东省预防兽医学重点实验室已建立的PCR反应体系[2]:模板2.0 μ L,10×PCR buffer3.0 μ L,dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μ L,MgCl2(25 mmol/L)4.0 μ L,3种序列的上下游引物(25 pmol/μ L)各0.5 μ L,TaqDNA聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,加H2O至30 μ L,吹打混匀后瞬时离心。PCR反应参数:94.5℃2 min;94.5℃30 s;55℃40 s;72℃1.5 min,35个循环;72℃再延伸9 min。反应结束后取5 μ L PCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,在凝胶成像系统上观察。

2 结果

2.1 NDV、IBV和AIV(H9)总感染情况

2009年下半年从山东潍坊、青岛、烟台三地区送检的774份病料中共有198份至少可检出NDV、IBV和AIV(H9)中的一种或多种,阳性率为25.58%,其中NDV阳性率为8.14%,IBV阳性率为11.37%,AIV(H9)阳性率为6.07%,说明2009年下半年NDV、IBV和AIV(H9)3种病毒在胶东主要养鸡地区中普遍存在,且3种病毒感染率相当(表2)。

表2 NDV、IBV和AIV(H9)的检测结果Table 2 The detection results of NDV,IBV and AIV(H9)

2.2 不同地区各病毒感染情况

2009年下半年,潍坊地区共送检病料142份,NDV、IBV和AIV(H9)的阳性率分别为5.63%、4.93%和14.08%;青岛地区共送检病料433份,NDV、IBV和AIV(H9)的阳性率分别为12.47%、14.55%和3.23%;烟台地区共送检病料199份,NDV、IBV和AIV(H9)的阳性率分别为0.5%、9.05%和6.53%(表3)。

表3 不同地区3种病毒的检出结果T able 3 The detection results of three viruses in different regions

2.3 不同月份各病毒感染情况

2009年下半年各月份3种病毒感染情况有所不同,7月AIV(H9)阳性率最高为25.58%,10月NDV和IBV阳性率都最高,分别为12.24%和16.33%(表4)。总体来看,气候寒冷月份3种病毒的感染率相对较高,说明3种疾病的发生与气温有一定关系。

表4 不同月份3种病毒的检出结果Table 4 The detection results of three viruses in different months

2.4 3种病毒混合感染情况

送检病料中NDV、IBV和AIV(H9)混合感染的现象比较普遍,二重感染阳性率为2.84%,其中NDV+IBV占2.45%,IBV+AIV(H9)占0.39%,被检样品中未发现有三重感染(表5)。

表5 3种病毒混合感染的检测结果T able 5 The detection results of co-infections of three viruses

3 讨论

目前,鸡病毒病的实验室诊断方法很多,常用的有病毒分离鉴定、血凝(抑制)试验、中和试验、免疫荧光和ELISA等方法,这些方法存在操作技术复杂,周期较长,特异性低、敏感性差等缺点,不易于大规模普查,在发生急性疫情或混合感染、隐性感染时,往往不能获得满意的效果[3]。PCR技术具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点,尤其对微量的样品或难以用组织培养的方法获得多量病毒样品的检测具有一定的优势,已广泛用于许多病毒和细菌的快速诊断与流行病学调查[4]。本次调查运用建立的PCR技术对山东潍坊、青岛和烟台地区的规模鸡场774份病料进行了NDV、IBV和AIV(H9)检测调查,结果表明所建立的PCR技术具有快速、敏感、特异、稳定等特点,用该技术对这些疾病进行早期诊断、流行病学调查,可为鸡传染病的防控提供重要依据。

本此调查从2009年7月至12月共历时半年时间,对山东胶东3个主要养鸡地区规模鸡场送检的774份病例进行了3种病毒感染情况调查,发现商业鸡群中该3种病毒性疾病均有不同程度的发生和流行,总感染率为25.58%,阳性率由高到低依次为IBV、NDV和AIV(H9),与我们在2008年1月至2009年6月期间对该三地区该三种病毒总感染率为65.76%的调查结果有很大差异,尤其是AIV(H9)的感染率由41.10%下降为6.07%,下降趋势尤其显著;IBV和NDV的感染率也有所下降,但下降不大[5]。感染率显著下降的主要原因可能与规模化养殖场使用免疫效果较好的新、支、流三联疫苗有很大关系;另一不可忽视的原因是去年冬天气候一直较寒冷气温不变化不大,降雪较多湿度较大,使AIV(H9)的感染率显著下降。尽管山东三地区鸡场三种病毒的感染和流行普遍存在,但三地区不同病毒感染的情况稍有差异,青岛地区NDV和IBV的阳性率均为最高,潍坊地区AIV(H9)阳性率最高,这可能与各地区三种疾病既往的流行病史、饲养管理和预防控制等措施密切相关。潍坊、青岛和烟台三地区在地域上紧密相连,而且交流频繁有关,但该三种疾病感染是否与地域有直接的关系,还有待进一步研究。2009年下半年各月份三种病毒感染情况有所不同,不同月份3种疾病的发生和流行稍有差异。9月份和10月份气候交替频繁,送检的病料也最多,三种病毒的阳性率都相对较高,说明寒冷季节是鸡呼吸道疾病的多发季节。本试验调查结果初步揭示了ND、IB和AI(H9)是造成山东省胶东地区当前鸡场呼吸道疾病经济损失的主要病因,这为有效预防和控制胶东地区鸡场的主要疫病提供科学依据。

NDV、IBV和AI(H9)是当前造成规模鸡场的主要疫病,不但可以单一感染,还可以混合感染或继发感染[6]。送检病料中NDV、IBV和AIV(H9)混合感染的现象较普遍,二重感染的阳性率合计达2.58%,NDV+IBV二重感染最为常见,IBV+AIV(H9)也存在。AI和ND能引起鸡一定程度的免疫抑制,免疫系统发育未成熟的雏鸡感染后,损伤机体的免疫系统,促进了其它病原体的感染力和致病力,造成混合感染的严重后果,不但直接影响鸡群的生长发育,加剧病鸡的临床症状,提高了发病率和死亡率,导致致病性细菌继发感染,而且使疫苗免疫效果不佳甚至免疫失败,使鸡病更加复杂和严重,加大了防控的难度[7-9]。因此,应该针对山东省胶东三地区3种病毒混合感染流行现状采取综合性的防制措施。

[1] 王洪利.2000-2002年山东省鸡主要病毒病流行情况调查[D].江苏南京:南京农业大学动物医学院,2004.

[2] 张 毅,尹燕博,韩丽敏,等.2007-2008年同一地点H9N2亚型禽流感病毒连续分离毒株HA基因序列分析[J].中国兽医杂志,2009,45(5):18-20.

[3] 张蓉蓉,罗青平,温国元,等.禽流感诊断方法研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(22):10507-10510.

[4] 杨克礼,韦 平,潘 玲,等.安徽省鸡免疫抑制性疾病的流行病学调查[J].中国兽医科技,2005,35(8):665-670.

[5] 徐守振,王 光,郭艳艳,等.胶东地区规模鸡场3种主要病毒感染情况的调查[J].动物医学进展,2010,31(2):78-83.

[6] 殷秀玲.冬春季节家禽呼吸道疾病的诱发原因及防制措施[J].中国家禽,2009,31(3):50-51.

[7] 韦 平,丁家波.几种引起家禽免疫抑制的病毒性疾病及其作用机理[J].中国预防兽医学报,2000,22(4):316-318.

[8] 崔治中.鸡群中免疫抑制性病毒、蛋传病毒的多重感染[J].中国家禽,2000,22(5):17-18.

[9] 李连任.我国鸡群免疫抑制性疾病的流行现状与防制对策[J].中国动物保健,2005(1):18-19.