均匀设计法优选中药免疫复方的试验

张 明

(菏泽学院生命科学系,山东菏泽274015)

多糖作为免疫活性成分对免疫功能的调节作用已经得到了证实[1-3],中药单方提取大多数都是以某一成分为指标,然后去研究其化学成分及其机理,而机体是一个多靶点、多层次、非线性的免疫系统,仅仅单方成分无法达到整体的免疫效果,随着中药现代化进程的加快,中药免疫复方的研究越来越受到重视[4-6]。本试验采用索式提取器连续回流提取法[7],应用免疫学原理和均匀试验设计相结合,以免疫器官指数(a)、巨噬细胞吞噬活性(b)和淋巴细胞增殖率(c)三项加权作为综合指标(t=0.2a+0.4b+0.4c),从器官、细胞水平上研究复方中草药多糖与免疫功能之间的相关性及回归关系,从而优选出最佳免疫复方,以其为中草药免疫增强剂以及保健酒、保健饮料的配方开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 黄芪、枸杞、人参和当归购于菏泽牡丹药店中药科。

1.1.2 实验动物 健康昆明小鼠120只,体重18 g～22 g,购于菏泽医学专科学校动物饲养中心。

1.1.3 仪器 DG-3022型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品;CO2培养箱为美国Reveo公司产品;75-2A型微量振荡器为上海医用分析仪器厂产品;恒温培养箱为天津市津北真空仪器厂产品;倒置显微镜及照相系统(O lym pus IX-50)为重庆光学仪器产品;721紫外分光光度计为上海第二仪器厂产品;96孔细胞培养板为德国Nunclon公司产品;RPM I1640培养液为Gibco公司产品;四甲基偶氮唑蓝(MTT)为Amresco公司产品;易得小鼠淋巴细胞分离液为达科为生物技术有限公司产品;二甲基亚砜(DMSO),分析纯,为Amresco公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 根据中药复方配伍原则,选取4种免疫效果好的中草药通过DPS统计软件对4个因素6水平进行均匀设计优选,优选方案见表1。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

1.2.2 水溶醇提法 取黄芪、人参、枸杞和当归粗粉按表1比例,置索式提取器圆底烧瓶中,按液固比为20∶1、提取温度为100℃、提取时间170 min,醇沉淀浓度比85%,回流提取,提取2次,滤过,合并滤液,用旋转蒸发仪减压浓缩,冰箱中放置24 h,最后2 000 r/min离心15 min,反复洗涤2次,最后真空干燥箱烘干,采用硫酸-苯酚法测其含量和得率[8]。

1.2.3 中药复方对小鼠免疫功能的影响

1.2.3.1 试验分组与动物处理 将120只(雌雄各半)试验小鼠,按照均匀设计随机分为6组,每组20只;小鼠禁食12 h后,试验用6组中药复方提取的多糖经计算按2 mg/kg药量每日灌胃0.5mL,连续7 d,于最后1次灌胃24 h后,每组随机取10只用于免疫器官指数观察,5只用于巨噬细胞吞噬活性的观察,另外5只无菌取脾,制成单个脾细胞悬液,用于测定脾淋巴细胞的增殖反应。

1.2.3.2 小鼠脾免疫器官指数的观察 每组取10只小鼠解剖后无菌取脾,电子天平称量脾重量和小鼠重量,计算免疫器官指数(免疫器官指数等于脾重量除以小鼠的重量)。

1.2.3.3 小鼠巨噬细胞吞噬活性的测定 取上述每组5只小鼠,按常规方法无菌收集腹腔巨噬细胞,经2 000 r/min离心,洗涤后,将收获的细胞悬浮于RPM I1640培养液中,分别调整细胞的浓度为1×106个/mL,接种于30 mm直径的培养皿中,置37℃中培养箱培养2 h后,弃上清液,用培养液充分洗涤培养皿3次以上,去除非贴壁细胞,台盼兰排斥法检测细胞存活率大于95%,取细胞悬液5mL于6mm直径的培养皿中,依次加入辣根过氧化物酶缓冲液100μL,37℃培养箱中15 min,分光光度计600 nm检测OD值[9](测OD值等于加药处理的OD值减去对照的OD值,然后除以对照的OD值)。

1.2.3.4 脾淋巴细胞增殖试验 取上述5只小鼠颈椎脱臼处死,无菌取脾脏,用灭菌生理盐水冲洗3次,加入5 mL易得淋巴细胞分离液,放入上面装有100目网孔的尼龙网袋中,用针桶挤压过滤收集细胞液,2 000 r/m in离心20 min,吸取中间云雾状白细胞层,用Hank＇s液洗2次。用RPM I1640营养液稀释成1×106/mL的细胞悬液,分别向96孔细胞培养板中加细胞,每孔100μL,重复4孔。另设无细胞调零孔。将细胞培养板放入体积分数为5%的CO2、37℃培养箱中培养44 h,每孔中加入20μL MTT液,继续培养4 h取出,各孔吸出上清液,加入DMOS 100μL,在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清,用酶联免疫检测仪570 nm下的吸光度作为淋巴细胞增殖的指标(测OD值等于加药处理的OD值减去对照的OD值,然后除以对照的OD值)。

1.2.4 数据分析 采用DPS9.50数据统计软件进行设计,运用多因子及互作项逐步回归统计方法进行分析[10]。

2 结果

2.1 各免疫指标的试验结果

结果见表2。1、2、3、4、4、5、6组的免疫器官指数分别为0.69%、0.80%、0.74%、0.84%、0.62%、0.76%;吞噬活性分别为24.14%、25.33%、25.22%、26.38%、24.89%、24.17%;淋巴增殖率分别为18.11%、19.34%、18.88%、19.64%、19.11%、18.67%。

2.2 中药免疫复方对免疫器官指数的影响

通过DPS统计软件,进行多因子及互作项逐步回归,结果见表3。由表3可知,除X2和X2×X3与Y之间负相关外,其它各单方及互作项间均达到正相关,而X1、X1×X3和X 1×X 4与Y之间分别达到0.93、0.71和0.80。回归模型优化方程为Y=0.634 7+0.006 4X1,统计量值F=25.48,p=0.003 8,相关系数R=0.92,表明方程拟合度良好,中药复方与免疫器官差异显著,最高指标时组合:X1=30;X2=11.64;X3=9.76;X4=15.76;Y=0.83。

表2 均匀设计试验与结果Table 2 Uniform design resu lts

表3 中药各单方及互相作用因素与免疫器官指数的相关性Table 3 The relativity of single drug prescription or interaction factors and immune organ indexes

2.3 中药免疫复方对吞噬活性的影响

通过DPS统计软件,进行多因子及互作项逐步回归,结果见表4,由表4可知,X 2、X1×X 2 X2×X3、X 2×X4与Y之间负相关外,其它各单方及互作项间均达到正相关。由表5可知,X2直接通经系数是-1.30,而X 1×X 3、X1×X4、X 2×X4的间接通经系数分别为0.11、0.04、0.50;X 1×X3、X2×X4的直接通经系数分别为0.75和0.65,而X 2对其间接通经系数分别为-0.19和-1.00。回归模型优选方程Y=25.709 7-0.124 1X 2+0.001 6X1×X3-0.000 5X1×X4+0.002 1X 2×X 4,统计量值F=4 464.39,p=0.01,相关系数R=0.91,表明方程拟合度良好,中药复方与巨噬细胞吞噬活性之间差异显著,最高指标时组合:X1=30;X 2=4;X3=36;X4=6;Y=26.85。

2.4 中药免疫复方对淋巴细胞增殖率的影响

通过DPS统计软件,进行多因子及互作项逐步回归,结果见表6,由表6可知,除X2和X2×X3与Y之间负相关外,其它各单方及互作均达到正相关,而X1、X1×X4与Y之间分别达到0.8、0.84。回归模型优化方程为Y=17.999 7+0.003 4X1×X 4,统计量值F=9.68,P=0.03,相关系数R=0.80,表明方程拟合度良好,中药复方与淋巴细胞增殖率之间显著。最高指标时组合X1=30;X2=5.83;X3=15.63;X4=36;Y=21.71。

表4 中药各单方及互相作用因素与吞噬活性的相关性Table 4 The relativity of single drug prescription or interaction factors and phagotrophy activity

表5 各单方及互相作用项的通经系数Table 5 The path coefficient of single drug prescription or interaction factors

表6 中草药各单方及互相作用因素与淋巴细胞增殖率的相关性Table 6 The relativity of single drug prescription or interaction factor and lymphopoiesis rate

2.5 中药免疫复方对免疫综合指标的影响

通过DPS统计软件,进行多因子及互作项逐步回归,结果见表7,由表7可知,除X2和X1×X2、X2×X3、X2×X4与Y之间负相关外,其它各单方及互作均达到正相关,由表8可知,X2、X1×X3、X2×X4直接通经系数分别为-1.05、0.71、0.39,但综合分析三者相关系数分别为-0.64、0.60、-0.30,回归模型优化方程为Y=18.1190-0.076 1X2+0.001 1X1×X3+0.000 9X2×X4,统计量值F值=31.43,P=0.03,相关系数R=0.97,表明方程拟合度良好,中药复方与免疫综合指标差异显著。最高指标时组合X1=30;X2=4;X3=36;X4=36;Y=19.10。

表7 中草药各单方及互相作用因素与免疫综合指标的相关及显著性Table 7 The relativity of single drug prescription or interaction factors and overall evaluation indexes

表8 各单方及互相作用项的通经系数表Table 8 The path coefficient of single drug prescription or in teraction factors

2.6 验证试验

取4种中草药粗粉,按X1=30;X 2=4;X 3=36;X 4=36配方提取复方分别测免疫器官指数、吞噬活性和淋巴细胞增殖率及综合指标,结果分别为0.83、26.30、19.15和18.72,此验证结果与均匀设计试验预测结果基本接近。

3 讨论

均匀设计法是一种多因素多水平试验设计方法,该方法通过各因素及互作项与测定指标之间建立回归模型,找出各因素及互作项的测定指标的相关性及显著性,再通过通经系数进一步寻找该配方中各因素及互作项对其的影响,最终优选出适宜的中草药免疫复方。

中药成分比较复杂,而生物体是一个多位点、多靶点复杂的体系,如果想单一把某种活性成分提取出来,然后再组合起来验证其功效,事倍功半,而中药之所以能治疗一些疑难杂症,可能是其中的某一个主要成分或者几个成分相互协调共同作用的结果,因此,单方提取纯化再组合就可能失去了某种有效成分,达不到其真正的疗效,而复方提取基本保持了原有的有效成分。可能在复方中,不仅各单药之间存在显著相关性,而且两两中药间存在互作效应,而且差异显著,本试验中黄芪和人参表现为协同效应,并且二者差异显著,而枸杞和当归也表现为促进作用,但差异不显著。通过免疫综合指标来代替免疫器官指数、吞噬活性和淋巴细胞增殖率3个单个免疫指标,从而建立一个全面的免疫复方筛选方法,本试验最优免疫复方组合为黄芪30 g,枸杞4 g,人参36 g,当归36 g,复方多糖含量49.15%,多糖得率为8.66%。

致谢:2006级生物科学班李苗苗、卢惠同学和朱道玉主任对该研究给予了支持和帮助,特此感谢。

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