猪精原干细胞的原子力显微镜检测

李盛璞,师如意,王秋兰,潘 洁,蔡继业*,张守全

(1.暨南大学化学系,广东广州510632;2.华南农业大学动物科学学院,广东广州510642)

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSC)是位于睾丸曲细精管基膜上的雄性生殖系干细胞,既具有干细胞的基本特征,即能进行自我增殖更新以维持自身群体恒定,又能定向分化产生各级生精细胞,直至精子,从而向子代传递遗传信息。因此,SSC是人和动物体内能将遗传信息传递给后代惟一的成体干细胞[1-2]。SSC承载着向子代传递遗传信息的能力,而细胞的表面微观结构和机械性能的变化和偏离都会影响SSC的生长、增殖、更新、分化等诸多方面的能力,进一步可能影响其在人体内发挥的作用。将猪的SSC在体外进行分离培养,并对其微观形貌和力学性质进行研究,有助于深入了解精子发生的调控机制,为探讨干细胞结构与体外培养[3]、自我增殖分化[4-5]、移植[6]等功能的关系奠定了基础。

原子力显微镜(atom ic force microscope,AFM)是1986年由Binning G,Quate C F和Gerber C等发明的[7]。通过使用一根约几微米长,针尖半径小于10 nm的探针来对样品的表面进行探测,通过探测针尖与样品之间的相互作用力(主要是范德华力)的变化来获得物体表面形貌结构的信息,其横向分辨率可达到0.5 nm以下,纵向分辨率可小于0.1 nm。由于此高分辨率的优势,AFM被广泛用于获取导体、半导体、非导体等表面微观信息。在生物医学方面,AFM比起其他显微镜,如:普通光学显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜(TEM、SEM)、激光共聚焦显微镜(LSM)等更体现了无法比拟的优势,其样品制备简单,损伤小;能进行三维立体观察;并进一步获取表面形貌和机械性能等定量数据[8-10]。本研究尝试使用AFM在单细胞水平上[11-12]研究从睾丸中分离纯化出来的SSC,重点是从纳米尺度上获取SSC的形态、超微结构[13]及表面膜的机械性能,为SSC膜表面定性、半定量、定量的研究提供了可视化证据。AFM是在微观领域对SSC基础研究的有效工具,其对SSC的探测结果在干细胞以及生殖方面的研究起到一定的提示作用。

1 材料与方法

1.1 材料

2.5 g/L胰蛋白酶、1.5mg/mL胶原蛋白酶Ⅳ、100单位/mL双抗为Sigma公司产品,100 mL/L胎牛血清(FCS)为H yclone公司产品,DM EM/F12为Gibco BRL公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离纯化及培养 联合使用胰蛋白酶与胶原蛋白酶对幼年猪的睾丸进行消化处理30 min,所得的细胞悬液用差速贴壁方法进行分离,每次为8 h～10 h,重复3次。所得纯化后的SSC在37℃、体积分数为5%的CO2、100%湿度条件下进行培养,以备下一步试验用。

1.2.2 样品制备 取SSC,滴在玻片上,自然铺展后吸附10 m in,先用pH 7.4的PBS缓冲液冲洗1次,然后用40 g/L的多聚甲醛固定15 min,再用蒸馏水冲洗3次,室温自然干燥。使用40 g/L的多聚甲醛固定SSC对其形貌和表面机械性质均影响较小。

1.2.3 AFM成像 将制备好的样品固定在AFM(Autoprobe CP Research,veeco公司,USA)的XY扫描台上,用监视器定位所要扫描的样品区域,在空气中室温下利用接触模式成像。试验中采用100μm扫描器,UL20B硅探针,力常数为2.8 N/m,AFM图像仅经自带软件IP2.1(Thermomicroscopes proscan image processing software version 2.1)平滑处理,以消除扫描方向上的低频背景噪音。利用AFM力位移曲线测量系统在同一加载速率下测量得到力的曲线进行统计分析。

2 结果

2.1 精原干细胞分离培养结果

经过双酶对幼年猪的睾丸进行消化处理30min后,测得消化液中细胞活率为92.41%±3.41%。消化液中细胞大部分为贴壁的睾丸支持细胞(STO),其余的是一些悬浮细胞,如:SSC、淋巴细胞、红细胞等[13-14]。差速贴壁法纯化后可明显分出STO与其他细胞,STO是一种贴壁生长的细胞,在整个溶液中测得细胞贴壁率为60.38%±6.45%。经过多次差速贴壁纯化后,悬液中的细胞几乎为SSC,还有极少量的淋巴细胞、红细胞和未贴壁的STO。SSC为成体干细胞,经由碱性磷酸酶染色鉴定(AP%)为91.61%±4.04%。将纯化后的SSC在、7℃,体积分数为5%的CO2、100%湿度条件下进行培养1周左右,仍保持细胞活性。

2.2 倒置显微镜分析

采用倒置显微镜对SSC分离纯化的过程进行观察,酶对睾丸消化处理后所得的溶液中,包含了几种不同细胞(图1A)。消化液中大部分为STO(图1C、图1E),贴壁细胞STO经过差速贴壁法处理后,吸附在培养瓶底部,呈不规则的长梭形。其他细胞如SSC、淋巴细胞、红细胞等均为悬浮细胞,存在于消化液中。经过多次差速贴壁后,溶液中基本不含有STO,大多数为SSC(图1B)。用碱性磷酸酶与OCT4免疫荧光标记染色(图1D、图1F),证明直径约在10μm～20μm之间的细胞确实为所需的SSC。通过倒置显微镜可明显看出SSC的形态,多呈圆形或轻微椭圆形,体积大、胞质较少、核大,明显区别于STO不规则的长梭形和红细胞呈现的圆盘状,虽然淋巴细胞大多也呈现圆形,但直径约为5μm左右,比SSC小1倍～2倍。通过倒置显微镜等仪器能宏观了解和区分SSC,但无法获得细胞表面的微观信息,因此再用AFM分析SSC结构和机械性质,微观与宏观相结合,进一步探测研究SSC的诸多性质。

图1 差速贴壁法分离猪的精原干细胞及鉴定Fig.1 Identification of porcine SSCs isolated by differential adhesion method

2.3 AFM对精原干细胞外形分析

运用AFM对30个细胞扫描统计,SSC直径为10μm～20μm(图2A),细胞高度分布在1.8μm～2.5μm之间(图2C)。细胞为较为光滑的圆球,表面不均匀分布着一些颗粒物质(图2B、图2D)。进一步获取更精确的扫描图,对SSC细胞膜进行5μm、1μm的超微结构分析,由误差信号图2D和光学图2F可知细胞表面局部较光滑,不像间充质干细胞那样粗糙,但仍存在一些大小不一的颗粒物质。膜表面颗粒分布图2G显示SSC表面颗粒大小为700 nm～900 nm。可能为膜表面的蛋白质、脂、糖等聚集物。选取多个不同细胞1μm×1μm膜表面超微结构图的整个区域,利用IP2.1分析软件对其进行测量,得到超微结构参数值:高低差(Rp-v)为(142.36±21.98)nm、均方根粗糙度(Rq)为(38.29±7.41)nm、平均粗糙度(Ra)为(31.13±7.51)nm、平均高度Meant H t为(118.77±11.05)nm。这些数据从普通光学显微镜无法得到。

2.4 AFM对精原干细胞机械性能分析

细胞膜表面的机械性能的变化用肉眼无法看见,但机械性能的改变影响着整个细胞的各种能力,所以在了解细胞结构信息之后有必要对力学性质进一步分析。AFM微悬臂自由端的探针接近、压入样品表面,然后脱离样品,此过程AFM测量并记录针尖的受力,从而得到力曲线(图3A)。AFM在细胞膜表面获得的每条力曲线都是系统自动测量15次得到的平均值。本试验测量30个细胞,每个细胞测量5个不同区域并进行统计,测量区域为2μm×2μm。细胞膜的机械性质主要是细胞的黏弹力、硬度、杨氏模量等。在相同的加载速率下,SSC与AFM针尖相互作用得到细胞表面力曲线的数据,统计具有代表性的100条,通过SPSS13.0统计分析,SSC机械性质均符合高斯分布(图3B、图3C、图3D)。黏弹力集中在47.31 pN±19.75 pN。硬度也是表征细胞膜表面力学性质的一个重要参数,胞膜表面的硬度为力曲线中退针时的斜率,即细胞的黏弹力与距离的比值,从而得到细胞表面的硬度为2.23mN/m±0.66mN/m,细胞表面硬度由细胞的骨架决定,影响细胞的流动性。由赫兹模型(Hertzm odel)[14-15]公式F=4E(Rδ3)1/2/[3(1–ν2)],可知细胞膜表面的杨氏模量与细胞表面的黏弹力有关,它反映膜表面的刚性。式中ν是泊松比,磷脂双分子层和细胞的ν=0.5;R是探针的半径,R＜10 nm;δ是压痕深度,为细胞膜厚度的1/10;E是杨氏模量,F是黏弹力。由公式算得杨氏模量为3.48 kPa±1.45 kPa。因此由所知机械性能数据就能从微观角度解释SSC的一些行为。

图2 精原干细胞(A～F)的AFM图和膜表面颗粒分布图(G)Fig.2 AFM images of SSC(A～F)and histog ram(G)

图3 精原干细胞膜表面机械性能的AFM测量结果Fig.3 Histog rams for mechanical properties of SSC

3 讨论

细胞生物学中,细胞的形貌和功能是紧密联系在一起的,细胞表面的微小变化就可能引起细胞性质和功能的差异。AFM是样品表面信息的收集工具,较易获得细胞的形貌、超微结构及其表面机械性能等信息,是在微观领域研究细胞的有力工具。本试验利用AFM对猪的SSC表面形貌进行了单细胞成像,定量的获得了细胞表面的超微结构数据(如膜表面平均粗糙度、表面颗粒大小等),同时对细胞膜表面的机械性质(黏弹力、硬度、杨氏模量)进行了测定,得出了相应的客观指标。纳米级别的分析为SSC的功能的深入研究提供了基础。整个试验过程样品处理简单、对细胞的损伤小、成像直观、分辨率高,获得定量的数据等都展示了AFM具有其他细胞表面形貌观察方法所无法比拟的优越性。借助AFM对SSC在微观领域的研究,为更好地理解干细胞的生理功能提供了可视化的依据,并对生殖方面也有一定的参考价值。

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