乳腺癌HER-2基因荧光原位杂交检测的临床应用

聂克克,马学真,何信佳

(1.青岛大学医学院第二附属医院肿瘤中心,山东青岛,266042;2.青岛大学医学院附属医院肿瘤科,山东青岛,266000)

乳腺癌为女性癌症发病率之首,且发病率呈 逐年上升的趋势。国外研究表明25%～30%的浸润性乳腺癌和80%的导管内癌患者有HER-2基因扩增。HER-2基因状态对乳腺癌的预后、风险评估、内分泌治疗、化疗、生物靶向治疗等方面都有决定性的影响,因此HER-2基因是乳腺癌的一个重要分子标志物和治疗靶,准确的HER-2信息具有重要的临床指导意义。目前HER-2基因检测的常用方法是免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH),前者检测蛋白表达,后者检测基因扩增。本研究通过比较二者的差异性和相关性,进一步探讨HER-2基因表达与乳腺癌患者临床病理的联系。

1 材料与方法

1.1 组织标本

选取我院2008年5月～2009年3月手术切除的乳腺浸润性导管癌标本40例,其腋窝淋巴结清扫数≥10,未行新辅助化疗、放疗及内分泌治疗。

1.2 主要试剂

免疫组化PV-6000试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。HER-2基因扩增FISH检测试剂盒(北京金菩嘉医疗科技有限公司)。

1.3 标本处理及方法

①玻片预处理:组织切片于65℃下烤片3 min,常规二甲苯脱蜡,梯度酒精(100%,85%,70%)水化。98℃沸水煮玻片20 min,立即37℃蛋白酶K消化5～10min(0.2 m L蛋白酶K储存液(20mg/m L)溶于40m L 2×SSC(柠檬酸缓冲液,pH 7.0)得到蛋白酶K工作液(200μg/m L),2×SSC洗涤5 min,1%甲醛固定10 min,梯度酒精(70%,85%,100%)脱水及丙酮固定各2 min,自然干燥玻片。②变性杂交:56℃,烤片2～5 min,配探针(1人份:杂交液7μL,去离子水1μL,探针 2μL),混匀,离心。玻片于70%甲酰胺中(75℃水浴箱)变性5 min,探针同时置于75℃水浴箱变性5min后置于46℃水浴箱中15min。玻片依次置于预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各3 min梯度脱水,自然干燥。取10μL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域,加盖盖玻片,封片。将玻片置于预热的湿盒中,42℃保温箱中过夜杂交(16 h左右)。③玻片洗涤与观察:46℃,50%甲酰胺洗涤10min×3,2×SSC 10 m in,0.1%NP-40 5m in。室温,70%乙醇洗涤3 min,暗处自然干燥。将15μL DAPI复染剂滴于玻片杂交区域,盖上盖玻片,暗处放置10～20m in,荧光显微镜下选用合适的滤片组观察玻片。

1.4 判断标准

IHC:C-erbB-2“阳性”定义为 3+表达,需要>30%的肿瘤细胞呈现强而完整的细胞膜着色;“可疑”定义为2+表达;“阴性”定义为 1+或0表达。

FISH检测:计数 30个细胞,统计 Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。Ratio<1.8为阴性结果,提示该样本无HER-2基因扩增;Ratio>2.2为阳性结果,提示样本中HER-2基因发生扩增;Ratio在1.8～2.2时,可以选择增加计数细胞至100个。众多红信号连接成簇时,可直接视为基因扩增。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,采用计数资料的Ridit检验。

2 结 果

本研究40例标本中IHC检测CerbB-2蛋白表达3+、2+、1+/0对应 FISH检测 HER-2基因扩增比例为 85.7%、50%、5.9%(表 1,图 1)。由表1看出IHC检测HER-2蛋白表达有较高的假阳性及假阴性,不能很客观的反映HER-2基因表达状况。FISH方法检测的有效性及准确性均显著高于IHC,可在临床广泛推广应用,评价预后,指导临床治疗。

表1 IHC与FISH检测结果

腋窝淋巴结阳性24例,其FISH检测HER-2基因扩增 10例(P=0.0399)。ER/PR阴性8例,其中6例HER-2基因扩增(P>0.05)。由此可见腋窝淋巴结阳性者HER-2基因扩增显著高于腋窝淋巴结阴性者。激素受体阴性虽与HER-2基因扩增无明显统计学意义,但受体阴性者HER-2基因扩增数较多。

图1 IHC与FISH检测结果

3 讨 论

随着分子生物学在医学领域应用的进展,原癌基因HER-2也成为当前研究的热点之一。HER-2基因或HER2/neu基因又称C-erbB-2基因,位于染色体17q12-2 l.32,编码1255个具有跨膜酪氨酸激酶活性的生长因子受体,是表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之一,分子量约为185 kD,因此又被称为p185。其与配体相互作用,通过细胞间信号传导,调节细胞生长、分化和增殖[1]。

FISH作为一门新兴的分子细胞遗传学技术,广泛用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。它以组织为基础,适用于存档保存的石蜡包埋组织块,通过检测基因拷贝数来评价HER-2DNA的水平,是HER-2基因检测的金标准。Yaziji等[2]采用高标准化实验流程,严密的质量控制和质量保证措施,对美国29个州135个研究机构的2 963个乳腺癌标本的研究显示:应用FISH检测HER-2基因扩增和IHC检测HER-2蛋白过表达结果之间有极好的相关性(91.6%),FISH失败率仅5%。另有研究显示:HER-2蛋白检测结果为IHC3+的病例中,FISH阳性率为78.2%～98.9%[3];IHC2+,来自不同研究者的FISH阳性检出率差别较大,为18%～44%[4-5]。本研究与上述数据基本相符。由此可见FISH检测HER-2基因扩增与IHC3+及IHC1+/-检测HER-2蛋白表达的一致性很好,IHC2+与FISH检测HER-2基因扩增之间的一致性较差,因此多数学者认为IHC2+者必须做 FISH以明确其基因状况。FISH之于IHC具有独特的优点:对低倍、高倍及染色体非整倍性扩增检测准确性高,灵敏度特异性好,结果为双色荧光信号,可排出绿色的荧光干扰,直接准确的得到目的基因扩增的拷贝数,是检测HER-2基因扩增的金标准。然而影响IHC和FISH之间一致性的因素包括技术本身的固有因素。如IHC中有抗体的选择,所用的技术操作程序、检测前组织的固定及观察者解释方面的差别。影响FISH检测的因素有组织保存、组织形态学、DNA探针的选择及解读的方法等。本实验IHC及FISH操作过程检测及结果分析在两名资深病理科医师的指导帮助下完成。

研究表明60.9%HER-2基因扩增阳性的乳腺癌癌细胞都具有核大、深染、怪异核或巨核等高度核异型性SBR组织学 3级表型。而 15.4%HER-2基因扩增阴性的乳腺癌癌细胞为组织学3级表型。HER-2基因扩增与淋巴结阳性、组织学分级、激素受体阴性有关[6],且HER-2基因扩增的乳腺癌患者预后差。但也有不同看法,Reed等认为HER-2蛋白过表达与预后和生存期无关,Berry等研究显示:HER-2状态并非影响抗激素治疗的效果等。本研究结果显示HER2基因扩增(FISH+)与淋巴结阳性相关,激素受体阴性虽与HER-2基因扩增无明显统计学意义,但受体阴性者HER-2基因扩增数较多,该数据考虑与样本量较少有关,因时间原因其预后及生存期暂无结果。HER-2基因扩增与抗激素治疗的关系及预后和生存期的相关性有待于进一步研究和探讨。

作为乳腺癌重要的分子标志物和治疗靶—HER-2基因,它通常影响下列治疗方案:①预测对含蒽环类治疗方案的敏感性;②预测对紫杉类治疗的敏感性;③预测对激素治疗的耐药性;④预测对CMF治疗方案的耐药;⑤曲妥珠单抗(赫塞汀)靶向治疗的指征。故准确的HER-2信息可以在获得更好治疗效果的同时避免不必要的治疗对患者造成的损害。而Risio等[7]发现17号染色体单体(monosomy)伴HER-2基因扩增的患者可能对曲妥珠单抗治疗的反应差,因此乳腺癌靶向治疗有待于进一步研究。

综上所述,HER-2是乳腺癌重要的分子标志物和治疗靶,其准确性对乳腺癌的治疗及预后具有重要意义。而FISH作为HER-2检测的金标准,可提供准确的HER-2信息,从而进一步指导临床治疗。

[1] 钱建军,史宏灿,仇丽红,等.乳腺癌中C-erbB-2与HIF-1基因表达相关性研究[J].实用临床医药杂志,2009,13(1):23.

[2] Yaziji H,Goldstein L C,Barry T S,et al.HER-2 testing in breast cancer using parallel tissue-based methods[J].JAMA,2004,291:1972.

[3] PressM F,Sauter G,Bemstein L,et al.Diagnostic evaluation ofHER-2 asamolecular target:an assessmentof accu racy and reproducibility of laboratory testing in large,prospective,random ized c linical trial[J].Clin Cancer Res,2005,11:6598.

[4] Dolan M,Snover D.Comparison of immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization assessment of HER-2 status in routine practice[J].Am JC lin Pathol,2005,123:766.

[5] Lan C,Liu JM,Liu T W,erB-b2 amplification by fluorescence in situ hybridization in breast cancer specimens read as 2+in immunohistochem ical analysis[J].Am J Clin Pathol,2005,124:97.

[6] 仇丽红,史宏灿,钱建军,等.荧光原位杂交和基因组半定量法检测乳腺癌组织中C-erbB-2基因扩增[J].实用临床医药杂志,2007,11(6):27.

[7] Risio M,Casorzo L,Redana S,et al.HER-2 gene-amplified breast cancers with monosomy of ch romosome 17 are poorly responsive to trastuzumab-based treatment[J].Oncol Rep,2005,13:305.