超声波辅助提取野生刺五加中总黄酮的工艺研究
2010-02-23杨芙莲聂小伟
杨芙莲， 聂小伟
(陕西科技大学生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)
0 引言
刺五加系五加科植物，是我国东北地区的典型药用植物，味辛、微苦、性温、无毒.现代医学研究证实，刺五加具有抗衰老、抗疲劳、抗癌及调节神经、内分泌、心血管功能以及提高机体对物理、化学、生物等有害剌激的抵抗能力等药理作用[1,2]，此外在神经衰弱、失眠、高血压病、冠心病、脑梗塞、脑动脉硬化、更年期综合症、血脂异常、糖尿病、风湿病、慢性支气管炎以及肿瘤等疾病的治疗中都有一定疗效[3,4].
经深入研究发现，总黄酮是刺五加中最重要的营养保健功能因子之一，它有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用，因而广泛用于医药、食品等行业，具有广泛的开发应用前景.本研究探讨了刺五加的总黄酮的提取工艺条件，采用分光光度法对其含量进行了测定，以期为野生刺五加的深度开发利用提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
刺五加粉：西安中药集团；芦丁对照品：北京药品生物制品研究所；亚硝酸钠：天津市化学试剂厂；硝酸铝：天津市顶福化工总厂；乙醚、丙酮及其它试剂均为分析纯.
1.2 仪器
SORVALL RC 3B PLUS 离心机(美国)；MA110电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；DK-98-1 电子恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；超声波粉粹仪(宁波新芝科器研究所)；紫外-可见分光光度计(上海精密仪器有限公司)；RE-52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-IIIA型不锈钢台式真空泵(巩义市瑞的仪器设备有限公司).
1.3 实验方法
1.3.1 超声波条件
超声波参数：超声波过程温度为5～55 ℃，频率25 kHz，超声时间10 s，工作间隙时间15 s.
1.3.2 标准曲线的绘制
准确称取120 ℃干燥至恒重的芦丁样品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇适量，置于水浴上微热使之溶解，再加甲醇至刻度，摇匀.精确量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀静止，即得0.2 mg/mL的芦丁标准溶液.
分别移取上述芦丁标准液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL放入1～6号10 mL容量瓶中，然后分别加入0.3 mL 5% NaNO2，摇匀，静置6 min；再分别加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀，静置6 min，而后又分别加入4 mL 4% NaOH，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，最后于510 nm下测定吸光度，以蒸馏水作参比液[5].
1.3.3 提取工艺流程
野生刺五加粉→过筛→称取一定量样品→用一定浓度的乙醇配制溶液→超声波提取→减压抽滤→无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→沉淀蛋白质、可溶性多糖→ 无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤→ 蒸发浓缩→ 恒温干燥→ 总黄酮粗品.
1.3.4 总黄酮得率的测定方法
精确称取处理得到的样品，用30%乙醇溶解后，按“绘制标准曲线”的方法进行操作，并以空白样为参照，在510 nm处测其吸光度.根据回归方程计算出刺五加样品中总黄酮的得率(mg/g).
图1 芦丁标准曲线
1.3.5 提取条件单因素试验
影响超声提取野生刺五加总黄酮的因素很多，本试验考虑到试验条件的限制，在设定“1.3.1”中超声波提取的工艺参数下，选取乙醇体积浓度、液固比、提取时间、提取功率4个影响提取效果的主要因素做单因素试验，以确定各因素的合适范围.
1.3.6 超声波辅助提取工艺正交优化
通过正交试验设计优化提取工艺，在单因素试验的基础上确定正交试验工艺参数的范围，选取乙醇体积浓度、液固比、超声时间和超声波功率4个主要影响因素的3个合适水平进行优化组合.
2 结果与讨论
2.1 芦丁标准工作曲线及线性回归方程
图1为芦丁标准的工作曲线，用最小二乘法进行线性回归得到回归方程为y= 0.012 0+18.742x，R2=0.997 2，其中y为吸光度，x为芦丁质量浓度(mg/mL).
2.2 单因素试验研究
2.2.1 乙醇体积分数对超声波提取总黄酮得率的影响
分别考察不同乙醇体积分数对超声提取总黄酮得率的影响，超声波条件：10.000 g左右的刺五加根茎，液固比为10∶1，超声时间为25 min，超声功率为420 W，结果见图2.
从图2可看出，根据相似相溶原理，总黄酮易溶于极性溶剂中，当乙醇体积分数小于60%时，其得率随乙醇体积分数的增大而增大，而乙醇的质量分数大于60%时，其得率随乙醇体积分数的增大变化不大.综合考虑，选取乙醇体积分数为60%时的提取效率较高.
2.2.2 液固比对超声波提取效果的影响
分别考察不同液固比对超声波提取总黄酮得率的影响，超声波条件：10.000 g左右的刺五加根茎，乙醇体积浓度60%，25 min，420 W，结果见图3.
由图3可以看出，液固比对刺五加中总黄酮的提取影响较大，得率随液固比增大而增大,可能是由于物料与试剂的接触表面积增大的原因；但液固比太大,提取液质量分数则小，对总黄酮提取纯化造成一定困难.从浸提效果、减少溶剂用量和降低浓缩负荷等方面综合考虑，在保证一定提取率的基础上选择液固比较小的比值.
图2 乙醇体积分数对超声波提取总黄酮得率的影响
2.2.3 提取时间对超声波提取效果的影响
分别考察不同超声波时间对总黄酮得率的影响，超声波条件：10.000 g左右的刺五加根茎，乙醇体积浓度60%，液固比5∶1，420 W，结果见图4.
由图4可看出，提取初期总黄酮得率随提取时间的增加而增大，且提取率增长很快；但越接近提取终点，总黄酮成分扩散越慢，杂质溶出越多，得率随时间的增大而增加较缓慢.这主要是由于总黄酮有一定的极性，非常容易被乙醇溶液提取.综合以上考虑选择提取时间以20 min为宜.
2.2.4 超声波功率对超声波提取效果的影响
分别考察不同超声波功率对总黄酮得率的影响，超声波条件：10.000 g左右的刺五加根茎，乙醇体积浓度60%，液固比5∶1，20 min,其结果见图5.
图4 提取时间对超声波提取效果的影响
表1 因素水平表
在试验范围内，一般来说超声功率越高越容易获得较大的影响，提取率随着超声波功率增大而增加.但是，超声强度对提取率的影响呈非线性关系,还需要考虑超声波与介质相互作用的程度和提取物的性质等多方面的因素.本试验在设定频率下，选用不同的功率进行提取.由图5可见，超声波功率在此范围内时，总黄酮提取率在小功率变化范围内波动不大，随着功率提高提取得率上升，在本试验中最佳提取功率为500 W[6].
表2 L9(34)正交试验设计及极差分析结果表
2.3 正交试验
选用L9(34)正交表进行试验，并以总黄酮的得率为考察指标，试验因素水平见表1.
由表2可知，各因素对总黄酮得率指标影响的逐次顺序为A>B>D>C，依据k1、k2、k3、k4确定最佳提取工艺组合为A1B1C2D2.由本正交试验结果R值的大小可以看出乙醇浓度对总黄酮得率的影响最大，液固比的影响次之，超声波功率影响较小，提取时间的影响最小，由此得到提取刺五加中总黄酮的最佳提取工艺条件如下：乙醇的浓度为60%，液固比为5∶1，超声波提取时间为20 min，超声波功率为500 W，此条件下总黄酮得率达到22.462 mg/g以上.
2.4 超声提取与其它提取方法的比较
对野生刺五加根茎采用不同方法提取，总黄酮的得率分别见表3.
表3 不同提取方法的总黄酮得率
由表3可见，乙醇浸提和超声波辅助提取法效果较好，但后者大大缩短了提取所需时间，提取溶剂用量少，降低了能耗，所以采用超声波辅助提取法提取效果更好.据资料表明微波辅助萃取法的效率也较好，但由于本试验微波萃取过程中的工艺条件选取不佳，使得提取不充分或总黄酮的结构遭破坏，导致本试验所得提取率相对较低[7].
3 结束语
本文对野生刺五加活性成分之一总黄酮的提取工艺进行了研究，并比较了不同提取工艺的提取率，得出超声波提取法的提取率最高.通过单因素试验研究了各相关因素对提取率的影响，设计了超声波法提取总黄酮的正交试验，确定出超声波法提取刺五加中总黄酮的最佳工艺条件如下：以60%乙醇作为溶剂，液固比为5∶1，超声提取时间20 min，超声波功率为500 W，此时得率达到22.462 mg/g以上.采用分光光度法测定了刺五加中总黄酮的含量，结果表明：本法简便、准确、灵敏度高、重现性好.该研究结果为刺五加的综合开发利用提供了科学依据.
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[7] Boryana Trusheva, Dorina Trunkova and Vassya Bankova.Different extraction methods of biologically active components from propolis: a preliminary study[J].Chemistry Central Journal 2007, 1:13 doi:10.1186/1752-153X-1-13.
