动物生理节律影响药物代谢过程的分子基础及其调节机制的研究进展

曾宪成，马 璟

(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203)

目前，由于体外研究技术手段的局限性及药品注册相关法规的要求，动物整体实验在药物研究与开发领域中仍发挥着不可替代的重要作用。药物在人或动物体内的动态过程是其药效或毒性作用产生的前提。给药时间不同，药物吸收、分布、代谢及排泄 (absorbance，distribution，metabolism and excretion，ADME)等药动学参数也将发生变化，即药物体内的动力学过程存在时间节律性。本文总结了国内外动物生理节律影响体内药物作用过程及其机制等方面的研究进展。

1 药理或毒理学实验中动物生理节律现象

在药理或毒理学实验中，最重要的就是确定剂量-效应之间的关系，然而在实验设计及结果分析时主要关注剂量设置及其对应的药效或毒性反应，而常常忽略给药时间对上述结果的影响。小鼠在不同时间点 ip给予镇痛药曲马朵(tranadol)后，于24:00(暗中期)给药急性死亡率最高，于4:00(暗后期)给药镇痛作用较强;另外，其体内药代动力学参数亦呈现出给药时间依赖性［1］。大鼠分别于12:00(光照饲养期)及24:00(黑暗饲养期)给予氯唑沙宗(chlorzoxazone)后，前者血液消除半衰期(t1/2)显著长于后者，但其经细胞色素P450 CYP2E1(cytochrome P-450 CYP2E1，CYP2E1)酶的代谢产物6-羟基氯唑沙宗(6-hydroxychlorzoxazone)8 h血浆浓度-时间曲线下面积(the area under the curve from 0 to 8 h，AUC0～8h)却明显短于后者［2］。大鼠给药时间不变，但当取样时间改变后，环磷酰胺(cyclophosphamide)诱导的小鼠骨髓微核率也具有时间节律性，在末次给药后6 h达到最高［3］。

2 肠道药物转运体的生理节律性表达及其调节机制

许多药物发挥其疗效主要取决于其跨越细胞屏障到达靶部位的能力，脂溶性药物通过被动扩散可以穿越肠道屏障而不需要特异的转运系统，但亲水性药物需要特异的转运体系进行跨膜转运。因此，在多种口服药物的动物体内吸收过程中，肠道转运蛋白发挥着重要作用。

2.1 肠道转运体的生理节律性表达

在肠道黏膜中有多种药物转运蛋白，包括介导药物吸收的有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide，OATP)、有机阳离子转运体(organic cation transporter，OCT)、肽转运体 1(peptide transporter 1，PEPT1)、单羧酸转运蛋白(monocarboxylate transporter，MCT)和多药耐药相关蛋白 1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)和MRP2，介导药物外排的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)。雄性SD大鼠空肠黏膜多药耐药蛋白1(multidrug-resistance protein 1，MDR1)，MCT1，MRP2，PEPT1及BCRP在转录水平呈现出时间节律性，MCT1及BCRP在光照期表达量最高，MRP2及PEPT1在黑暗期表达量最高［4］。PEPT1蛋白质及mRNA水平在雄性Wistar大鼠十二指肠的表达呈现出生理节律性，其mRNA及蛋白质的峰值表达均出现在20:00，谷值表达出现在 8:00［5］。 Na+-葡 萄 糖 共 转 运 体 1(sodium-glucose co-transporter 1，SGLT1)，葡萄糖转运体2(glucose transporter 2，GLUT2)及GLUT5是啮齿类动物小肠主要表达的几种己糖(hexose)转运体。雄性C57BL/6小鼠十二指肠及空肠中SGLT1，GLUT2及GLUT5表达在蛋白质及mRNA水平均呈现出时间节律性;十二指肠中mRNA在15:00表达量达峰值，而蛋白质表达量在9:00达峰值;空肠中SGLT1 mRNA表达量在21:00达峰值，GLUT2和GLUT5 mRNA在15:00达峰值，三种蛋白质表达的峰值水平均出现在3:00，其中GLUT2可以维持到9:00;而回肠中三者仅在mRNA水平被观察到有时间节律性，它们的峰值表达量出现在21:00［6］。雄性大鼠十二指肠中SGLT1的mRNA及蛋白质峰值表达量均出现在20:00，而峰谷表达量出现在8:00［5］;空肠中其 mRNA表达量在16:00达峰值，蛋白质的峰值表达则出现于22:00;但在回肠中仅mRNA水平表现出时间节律性，它在22:00表达量达峰值［7］。阐明上述葡萄糖转运体的时间节律性规律及其调节机制不仅有助于推动多种疾病如糖尿病、肥胖性疾病和吸收紊乱等的治疗，另外也将推动对上述转运体参与的药物动力学时间节律性的认识，因为槲皮素-4'-β-葡糖苷(quercetin-4'-β-glucoside)和槲皮素-3-葡糖苷(quercetin-3-glucoside)已被证实是 SGLT1 的典型底物［8－9］。

2.2 肠道转运体生理节律性表达的调节机制

下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)及外周组织如肝脏、心脏、脂肪组织及小肠等的生物钟共同构成了机体节律计时系统(circadian timing system)，且两者在组成成分及调节机制方面基本相同，主要由一系列相互联系的反馈回路(feedback loop)组成;时钟蛋白(clock protein)及脑和肌肉组织芳香羟受体核转运蛋白的类似蛋白1(brain and muscle ARNT-like 1，BMAL1)组成了正向调节支路(positive limb)，周期时钟蛋白(period clock protein，PER)1、PER2、蓝光受体隐花色素 (cryptochrome，CRY)1及CRY2组成了负向调节支路(negative limb);孤儿核受体Rev-erbα组成了另一条反馈调节支路;富含脯氨酸和酸性氨基酸碱性亮氨酸拉链(proline and acidic amino acid-rich basic leucine zipper，PARbZip)的转录因子白蛋白基因D位点结合蛋白(albumin gene D-site binding protein，DBP)、肝性白血病因子(hepatic leukemia factor，HLF)及促甲状腺素胚胎因子(thyrotroph embryonic factor，TEF)共同组成了用于介导机体生物钟下游反应的输出性调节子(output regulators)［10－12］。其中，DBP蛋白在调节生理节律性反应时发挥着十分重要的作用。一方面DBP蛋白通过与PER1启动子区结合而与时钟蛋白及BMAL1形成的复合物共同诱导其转录，另一方面DBP转录分别受到时钟蛋白-BMAL1复合物诱导及PER和CRY蛋白抑制调控［13］。DBP在小肠的时间节律表达时相与PEPT1蛋白一致，并且通过与PEPT1启动子区结合而诱导PEPT1转录［14］。因此DBP在PEPT1生理节律性表达中发挥着重要作用。迷走神经在机体许多内部器官功能调节方面发挥着重要作用，同时它也参与了肠道葡萄糖转运体时间节律性调节。大鼠腹部迷走神经被切除后，空肠 SGLT1、GLUT5及GLUT2 mRNA的表达仍具有生理节律性，但 SGLT1及GLUT2蛋白质水平的时间节律性表达未曾见到，迷走神经似乎通过mRNA转录后或翻译后加工参与葡萄糖转运体生理节律性调节［15］。但是，迷走神经不参与SGLT1蛋白质水平的时间节律性表达目前尚存在争议［16］。碱性亮氨酸拉链转录因子腺病毒E4启动子结合蛋白4(adenovirus E4 promoter ATF site binding protein 4，E4BP4)及HLF通过竞争结合相同DNA位点而对小肠MDR1a基因转录产生不同方向的调节作用;E4BP4含量在体内周期性波动，仅在含量高时抑制MDR1a转录，HLF对MDR1a的转录具有活化作用［17］。

3 肝脏药物代谢酶的生理节律性表达及其调节机制

肝脏是迄今已知最重要的药物代谢器官。药物代谢酶在外源性或内源性化合物代谢或解毒过程中发挥着重要作用。根据它们参与的药物代谢反应时相，可分为Ⅰ相酶和Ⅱ相酶，Ⅰ相酶主要有肝微粒体中CYP450;Ⅱ相酶主要有尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases，UGT)、谷胱甘肽-S-转移酶 (glutathione S-transferases，GST)、磺基转移酶(sulfotransferases，SULT)和N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferases，NAT)等。另外肝脏还分布有参与药物转运的多种转运体，包括P-gp、MRP、BCRP及MDR等。

3.1 肝脏药物代谢酶的生理节律性表达

早期对肝脏药物代谢酶生理节律性的研究主要通过监测酶活性及相应代谢产物含量。小鼠GST活性光照期(7:00－19:00)高于黑暗期(19:00－7:00)，且具有底物特异性，24 h 内分别作用 1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，CDNB)与 1，2-环氧-3-(对硝基苯氧基)丙烷［1，2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propane，EPNP］2 种底物，相应酶活性的峰谷值出现的时相是相反的，酶与CDNB反应的峰值出现在13:00，谷值在1:00［18］。基因芯片技术可以同时观察影响机体的许多重要生理功能基因的生理节律性表达。在Fisher 344雄性大鼠3906个基因中，1171(30%)个基因可被清晰的观察到具有时间节律性，其中1029个(88%)基因峰值表达增加倍数小于1.5，在67个显著性表达增加的基因中包含CYP4A3的基因及推定的乙酰基转移酶camello 4(putative N-acetyltransferase camello 4，Clm4)的基因，肝CYP4A酶异构体主要通过催化生成20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acids)而调节肾动脉和肾小管离子转运，Clm4在芳香胺及联氨乙酰化反应中发挥着重要作用［19］。在CD-1雄性小鼠肝脏2122个基因中，187(8.8%)个基因的表达呈现出明显的时间节律性，其中与药物代谢有关的有GSTθ2，CYP17，CYP2A4及 CYP2E1，四者 mRNA 表达均在夜间达到最高［20］。另外CYP2C22、羧酸酯酶基因及gst基因在小鼠肝脏中亦呈节律性表达，GST的cDNA峰值表达出现在8:00，CYP2C22及羧酸酯酶的cDNA峰值表达则出现在20:00［21］。小鼠肝脏Ⅰ相药物代谢酶的mRNA通常在黑暗期表达增加;CYP2B10的峰值表达出现在2:00，而峰谷表达则出现在2:00;CYP2E1及CYP3A11的峰值表达则分别出现在22:00和2:00;CYP1A2的峰值表达出现在6:00;CYP4A14的节律性表达略显复杂一点，它在光照期会维持在一个较为稳定的水平，在18:00表达量达峰值，至黑暗中期(22:00－2:00)下降至峰谷水平，在光照期又恢复至较高水平［22］。Ⅱ相酶 mRNA的表达多数在光照期达到峰值;UGTLA家族的UGT1A1，UGT1A6及UGT1A9和UGT2家族的UGT2A3，UGT2B35及UGT2B36峰值表达量均出现在14:00，而UGT1A5在2:00表达量最高，UGT2B34在6:00表达量最高;SULT1A1，SULT1D1及SULT5A1的峰值表达出现在光暗过渡期;GSTA1，GSTA2，GSTA4，GSTM1，GSTM2，GSTM3，GSTM4及GSTM6的最高表达均出现在光照早期10:00，最低表达则出现在黑暗中期22:00，GSTT1在光暗过渡期6:00和18:00表达量会升高，而GSTT2在黑暗期会增加表达［22］。BCRP，MRP2及MDR2在24 h内的表达波动幅度小于2倍，但MDR1的波动幅度却超过2.9倍，且在22:00出现峰值表达［22］。上述研究结果表明，参与动物体内药物处置过程的肝脏药物代谢酶和转运体及其亚型mRNA的表达多数具有生理节律性，而且峰谷值出现时相不一。在使用药物时应该首先弄清楚参与该药体内处置过程的肝脏药物代谢酶和转运体的种类，然后结合这些酶和转运体表达及功能的生理节律性设计出合理的给药和取样时间，以获取最大药效或者更多不良反应等信息。

3.2 肝脏药物代谢酶生理节律性表达调节机制

肝脏药物代谢酶生理节律性表达受到肝脏自身时钟基因的调节。在Wistar大鼠肝脏中，PER2、BMAL1、DBP、核受体超家族成员1d1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1，Nr1d1)及Nr1d2 5种时钟基因的表达呈现出明显的生理节律性［23］。当小鼠肝脏BDP，TEF及HLF三种基因同时被敲除后，组成型雄烷受体(constitutive androstane receptor，CAR)调节的CYP450酶CYP4A和CYP2C，CAR调节的多种药物代谢酶，包括CYP2B及CYP3A等Ⅰ相酶，GST及UGT等Ⅱ相酶，ATP结合盒蛋白(ATP binding cassette，ABC)G2、ABCC4(MRP4)、ABCA8A、ABCA6 及 ABCB1B 等药物转运体，氨基乙酰丙酸合酶1(aminolevulinic acid synthase 1，ALAS1)和CYP450氧化还原酶的基因表达均发生变化［24］。

4 肾脏药物排泄功能的生理节律性变化及调节

肾脏在药物、有毒物质及其代谢产物的清除过程中也发挥了重要作用，主要通过肾小球滤过、肾小管分泌及肾小管重吸收等途径完成对上述物质的清除。大鼠尿蛋白含量、肾小球滤过率及肾血浆流量在夜间活动期均高于休息期［25］，另外，动物尿液pH值也可呈现出生理节律性变化［26］。上述肾脏生理功能的节律性变化均可影响它对药物的清除过程。肾脏存在时钟基因 rPER1、rPER2、rPER3、BMAL1及 DBP，并且呈现时间节律性表达，它们在20:00的表达量均高于8:00［27］。Na+/H+交换体3在维持机体电解质及酸碱平衡过程中具有重要作用，其mRNA表达呈现节律性变化并且时钟蛋白/BMAL1异二聚体调控［28］。Na+对维持胞外液体积及血压发挥着关键作用，在醛固酮调节下，通过表皮Na+通道从肾小管液被吸收至胞外，表皮Na+通道的mRNA表达具有明显的时间节律性，PER1参与了上述过程的调节［29］。

5 展望

在肠道、肝脏及肾脏等重要生命器官中，与药物代谢过程密切相关的转运体及代谢酶的功能发挥具有不同程度的时间依赖性。因此，在考察药物疗效及其毒性研究中，除关注剂量-效应关系外，还应考虑给药时间-效应关系。严格控制动物光照时间及程序，合理设计及精确控制动物给药及采样时间点对遵守动物生理节律规律并消除其对实验结果的影响具有重要的保障作用。目前，多数研究是从mRNA水平，依靠基因芯片技术对上述药物转运体、代谢酶功能的时间依赖性规律进行了研究。基因芯片技术可以呈现出不同时间条件下组织或者细胞的基因表达谱，可以很方便的筛检出感兴趣基因。但是，药物转运体、药物代谢酶及相关调节因子大部分是以蛋白质形态发挥功能，基因转录后及翻译后的调控使得mRNA与蛋白质表达水平并不能始终一致。因此，应该从蛋白质水平考察它们的时间节律性及其调节机制，引入蛋白质组学理论和技术，将会加快本领域的研究进程。肝脏自身生物钟相关基因已被证实参与了药物代谢酶时间节律性表达的调节，并且肝脏生物钟调节需要SCN参与［30］，但SCN是否参与肝脏药物代谢酶调节及其机制需要进一步研究。肾脏分布有大量的转运体，与药物代谢有关的包括ABC转运体及溶质转运体家族，这些转运体表达是否具有生理节律性及其调节机制也需要进一步研究。

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