口蹄疫病毒T细胞表位研究概况

刘新生，王永录

(中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃 兰州 730046)

在机体的免疫应答过程中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个抗原分子，而只识别抗原大分子上的一个特定的部分，该部位称为表位或抗原决定簇［1］。T、B细胞分别通过 T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)和B细胞抗原受体 (B cell receptor，BCR)识别抗原，介导细胞免疫和体液免疫，是适应性免疫应答的主要参与者。与B细胞对抗原的识别不同，T细胞不能识别完整的天然抗原分子，需要抗原提呈细胞 (APC)的协助，并且由组织相融性抗原复合物 (MHC)分子将表位肽段递送至细胞表面才能识别。该过程包括抗原的加工和提呈、免疫突触的形成，T细胞和APC间的相互作用，以及抗原肽与MHC分子、TCR分子间的相互作用等。

表位是蛋白质抗原性的基础，是抗原分子中诱生特异性免疫应答的基本结构和功能单位。根据结合表位的抗原受体细胞不同，将表位分为B细胞表位和T细胞表位［2］。线型表位见于 T细胞表位和部分B细胞表位，构象型表位只见于B细胞表位。

口蹄疫 (foot-and-mouth disease，FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，是世界上危害最严重的家畜传染病之一。一般认为动物机体针对FMDV的抗感染免疫主要与高水平的抗体有关，因此对B细胞表位研究开展的较早且深入。但随着研究的不断深入，发现细胞免疫在口蹄疫免疫应答中也扮演着非常重要的角色。近年来，对口蹄疫病毒结构蛋白和非结构蛋白抗原上的T细胞表位进行了广泛的研究并发现了许多新的T细胞表位。全面了解FMDV T细胞表位，对准确而详尽地绘制其抗原表位图谱、监测病毒抗原变异、正确理解病毒致病的分子机制、定点改造免疫原性相关的蛋白质分子以及口蹄疫病毒表位疫苗的研制具有重要意义。

1 T细胞表位研究方法

1.1 分类

T细胞表位是指在特异性免疫应答中，抗原经抗原递呈细胞处理后，由MHC分子向T细胞表面抗原受体 (TCR)递呈的线性肽段。T细胞对抗原的识别主要由 TCR-抗原表位-MHC分子的三聚复合体来完成。其中 MHC分子可以为MHCⅠ类和MHCⅡ类分子，虽然它们在结构上有许多相似之处，但在免疫识别过程中所起的作用却是不同的。MHCⅠ类分子主要提呈产生于抗原提呈细胞内部的抗原肽，MHCⅠ类分子和抗原肽的复合物主要与CD8+CTL细胞上TCR结合，介导T细胞毒性免疫应答，因此这类 T细胞表位被称为CTL或CD8+T细胞表位;而MHCⅡ类分子主要递呈从细胞外环境中摄取的抗原，MHCⅡ类分子和抗原肽的复合物主要与CD4+Th细胞结合，激活Th细胞以辅助B细胞产生抗体。这类T细胞表位称为Th或CD4+T细胞表位。此外，活化的 Th细胞还产生一些细胞因子，介导NK细胞等免疫细胞产生细胞免疫应答。

1.2 筛选方法

1.2.1 合成重叠肽法

合成重叠肽法是根据抗原蛋白的氨基酸序列随机合成或连续合成一个或几个重叠氨基酸的一系列肽段，然后通过淋巴细胞功能实验确定可被T细胞识别的肽段，即T细胞表位。此法是目前确定T细胞表位研究中应用最为广泛的方法之一。虽然通过此方法已成功的确定了许多T细胞表位，且表位较可靠，但该方法有其局限性，主要是工作量大、费用高，而且由于合成的重叠肽一般是10个氨基酸，其中有5个氨基酸重叠，因此重叠区之间的表位就可能被忽略了，所以不能够鉴定出目的蛋白上所有的T细胞表位。

1.2.2 计算机软件预测法

此外，除了上述两种方法外，质谱分析技术［3］和噬菌体展示技术［4］也被应用于 T细胞表位的筛选。

1.3 检测方法

1.3.1 淋巴细胞转化实验

淋巴细胞转化试验 (lymphocyte transplant Test)(简称淋转)是利用淋巴细胞与抗原或有丝分裂原在体外共同培养，使淋巴细胞的代谢和形态发生一系列变化，进一步转化为淋巴母细胞这一特性来反映机体免疫学状态的一种测试方法，是细胞免疫的一个测定指标［5－6］。目前，在淋转试验中最常使用的两种方法是MTT比色法和3H-TdR掺入法。

1.3.2 胞内细胞因子染色法

抗原特异性 T细胞经抗原表位肽短暂的、细胞因子分泌被抑制的体外刺激后，用多色流式细胞仪检测产生细胞内细胞因子，即可确定抗原特异性T细胞的频率。胞内细胞因子染色可准确地分析特定的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的抗原特异性应答，并可在一个抗原特异性T细胞中综合分析多种细胞因子的分泌。胞内细胞因子染色技术作为一种独特的研究T细胞应答的方法，已广泛应用于CD4+T细胞、CD8+T细胞表位的鉴定及其特异性应答的研究中。

1.3.3 酶联免疫斑点法

ELISPOT通过对T细胞分泌的各类细胞因子的检测，间接的对机体内分泌特定细胞因子的T细胞的频率进行测定。其实验原理是:由于受到刺激后的细胞会局部产生细胞因子，利用已被包被在固相上的特异性单克隆抗体对细胞因子进行捕获，通过洗涤将细胞和未结合的其他细胞因子洗脱，加入生物素标记的识别另一表位的单克隆抗体，被捕获的细胞因子与其结合，再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合，BCIP-NBT底物显色后，可在PVDF膜上出现蓝紫色斑点，可由此计算出分泌特定细胞因子的T细胞频率。

技术组收到的稿件主要涉及三个方面:数字化教学与数码互动、教学教改与创新、教学与科研技术的应用与体会。同行报告展示了各自工作中教学及教学改革的经验和体会，以及教学与科研技术方面的应用与技术改进的成果。通过参会代表的现场评选，并结合专家的评审意见，推举出6篇教学和技术优秀论文奖。

ELISPOT是单细胞水平的检测，比 ELISA更灵敏，能从20万～30万细胞中检出1个分泌该细胞因子的细胞。ELISPOT具有灵敏度高，所需细胞数较少的特点，比较适用于对较大数量抗原肽的大规模筛选。近年来报道的CTL表位和Th细胞表位绝大多数是用ELISPOT方法鉴定的。

1.3.4 MHC四聚体技术

四聚体技术将MHC重链的氨基端生物素化，生物素化的MHC-肽复合物可与荧光素 PE标记的链霉亲和素结合，利用亲和素上的4个生物素结合位点，将4个MHC分子交联在一起形成一个复合物。这种荧光素标记的四聚体可与其抗原表位肽特异的CTL发生特异性结合，通过流式细胞仪即可有效地检测特异性T细胞的频率，应用于表位特异性T细胞的研究。但由于应用四聚体技术检测特异性T细胞的每条肽都要和特定的MHC分子制备成四聚体，而四聚体的制备需要有良好的技术，费用也比较昂贵，不利于对T细胞表位进行大规模筛选，在一定程度上限制了四聚体技术在T细胞表位研究中的应用。

1.3.551Cr释放试验

51Cr释放试验是经典的研究 CTL表位的实验方法。其实验原理是效应CTL识别靶细胞表面提呈的抗原肽-MHC复合物后，可对靶细胞发挥杀伤作用。用 Na512CrO4;标记靶细胞，若CTL能杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞内释出。以计数仪测定上清中51Cr的放射活性，就可测定效应细胞的杀伤活性。但51Cr为放射性元素，受半衰期和同位素污染的限制。

1.3.6 荧光测定法

荧光测定法是近年来发展的，其原理是用相同或不同的荧光染料对靶细胞和效应细胞进行染色，然后共同培养，根据荧光强度的变化，通过荧光扫描或流式细胞仪即可定量检测特异性CTLs。

虽然新技术不断出现，但每种方法都有其局限性，单一的方法不能够进行全面准确的检测，需要多种检测方法相互结合使用，从而提高其准确性。

2 FMDV T细胞表位研究概况

2.1 FMDV基本特征

口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus，FMDV)是小 RNA病毒科 (picornaviridae)，口蹄疫病毒属 (aphthovirus)的成员。到目前为止，已发现了7个血清型，即O、A、C型 (称欧洲型)，SAT1、SAT2、SAT3(南非 1、2、3型，称非洲型)和Asia(亚洲型)，群内各型同源性达60% ～70%，但两群之间同源性仅为25% ～40%，血清型间无血清交叉和交叉免疫现象。FMDV为正二十面体结构，直径20～30 nm，分子量为6.9×106 u，沉降系数为140～146 S。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA部分，其基因组编码4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和8个非结构蛋白 (L、1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。

2.2 FMDV T细胞表位

2.2.1 结构蛋白T细胞表位

FMDV 感染时中和抗体的产生需要B细胞表位和T细胞表位的相互作用，缺少了T细胞表位的疫苗不能够刺激机体产生有效地免疫保护［7］。这说明T细胞表位在FMDV的抗原构成和免疫应答中也起着很重要的作用。

Th细胞属于CD4 T细胞亚群，主要协助其它免疫细胞发挥功能，如辅助B细胞分化和合成抗体、增加其它CD8 T细胞的增殖功能使其更好的发挥杀伤靶细胞的功能、协助巨噬细胞产生迟发型变态反应等。Th细胞是有效实施庞大的特异性免疫应答的必要保证。使被抗原活化的B淋巴细胞产生抗体和抗体特异性细胞毒性T淋巴细胞 (Tc)变成效应器细胞都必须与受抗原刺激的Th相互作用。对合成肽研究过程中发现，合成肽的低免疫原性与缺乏Th细胞表位有关，而通过增加额外的Th细胞表位可以克服FMDV合成肽反应的MHC限制性。因此，Th细胞表位的不断深入研究，对口蹄疫的免疫学研究有着重要意义。FMDV VP1的G-H Loop中不仅有诱导B细胞的位点，而且存在激发辅助性T细胞 (Th细胞)的位点。

1991年，Collen等［8］通过淋巴细胞转化试验研究发现，FMDV140S、12S和分离的 VP1-3均能在体外刺激牛的淋巴细胞增殖，并确定了刺激活性的残基位于 VP1的21～40位以及 161-碳末端序列。由于VP3诱导了淋巴细胞转化，说明VP3上也包含Th细胞表位，并证实口蹄疫病毒的Th表位有改善肽疫苗免疫原性的潜能。1994年，Rodriguez等［9］在猪抗 FMDV结构蛋白 VP1的抗原特异性T细胞研究中，将目的蛋白在大肠杆菌中表达，并通过淋巴细胞转化试验，在体外对免疫动物的PBMC进行刺激，发现在VP1上存在有Th细胞表位，进一步的实验表明，该位点能克服牛MHC的遗传限制。同年，Zamorano等［10］确定在VP1的135～144和150～160位氨基酸残基上存在2个T细胞表位，并且在牛的抗FMDV免疫作用中起到了积极的作用。1995年，Lierop等［11］以牛为实验动物，分离免疫动物的外周单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)，通过淋巴细胞转化实验证实在VP1的140～160位存在T细胞表位。2007年，Wang等［12］以豚鼠为模型，对Asia1型FMD YNBS/58株研究发现在VP1的133～163位、VP2的1～33位氨基酸包含有抗原位点，两者均可诱导豚鼠的淋巴细胞增殖。

关于FMDV T细胞表位的研究最初主要集中在VP1上，后来才扩展到病毒的其它结构和非结构蛋白上。近年来，对其他结构蛋白的研究也在不断的深入。1999年，Toja等［13］对C型 FMDV研究后证实，在FMDV衣壳蛋白上有多个能被牛和猪淋巴细胞识别的T细胞表位。2000年，Blanco等［14］通过合成重叠肽法合成了覆盖FMDV结构蛋白VP4全长的14个肽段，利用淋巴细胞转化实验确定在VP4的20～34位存在T细胞表位。然后他们又将确定的此T细胞表位与结构蛋白VP1上137～156位的1个B细胞表位串联后再1次进行淋巴细胞转化实验，发现与此T细胞表位单独刺激的结果相比，T，B细胞表位串联后刺激猪的PBMC细胞增殖的效力减弱，但比B细胞表位单独刺激的效力要强。同年，Filgueira等［15］使用小鼠模型，通过淋巴细胞转化实验研究了结构蛋白 VP2、VP3和VP4上的T细胞位点，发现在FMDV O1C株的结构蛋白VP2、VP3和VP4上至少存在10个T细胞表位，其中VP2上49～68位、113～132位、179～198位，VP3上81～100位、129～148位，VP4上17～36位，都具有明显有效的Th刺激功能。

2.2.2 非结构蛋白T细胞表位

FMDV非结构蛋白在免疫保护性应答中也起着积极的作用。而且，非结构蛋白在各个血清型之间较为保守，其上有些T细胞表位可产生交叉性免疫保护。因此，非结构蛋白上T细胞表位的研究也是十分重要的。1998年，Foster等［16］系统的研究了非结构蛋白对被不同血清型的FMDV感染动物的体液和细胞免疫反应，并确定FMDV 3D上存在T细胞表位。2001年，Blanco等［17］通过合成重叠肽法，利用T细胞增殖实验研究了FMDV非结构蛋白3ABC上的T细胞表位，结果发现在3A上21～35位存在 T细胞表位。2004年，Garcia-Briones等［18］经淋巴细胞增殖试验检测得出，对FMDV3D蛋白识别的T细胞属于Th细胞亚群，3D蛋白包含能有效的识别猪T淋巴细胞的表位，而异源病毒相对于接种的重组鸡痘病毒的3D来说不能获得保护。2006年，Wilhelm Gerner［19］通过合成肽重叠法合成了覆盖FMDV3D的15肽，分离被免疫的猪的PBMC，然后与候选表位进行淋巴细胞转化实验，筛选出 FMDV非结构蛋白3D346aa～370aa存在T细胞表位，并用ELISPOT实验检测了其正确性。

2.3 FMDV表位疫苗

表位疫苗是指同时携带多个目标抗原相关表位以及辅助性表位的疫苗。通过分子生物学手段可筛选出病毒的B细胞和T细胞表位，以及其它淋巴细胞表位，同时对表位进行优化，从而研制出多表位疫苗。多表位疫苗有能克服MHC分子的遗传限制，可被多种遗传背景的MHC分子识别结合，并被高效递呈等优势。由于传统FMD灭活疫苗有自身的一些缺陷，如灭活不完全，可能引起散毒和不能产生交叉保护等，所以研制更加高效安全的新型疫苗就十分必要。表位疫苗作为一种新的疫苗设计思路，已逐步成为口蹄疫新型疫苗研究中的热点。

FMDV粒子T细胞表位的不断确定为构建表位疫苗奠定了坚实的基础。现国内外很多学者都致力于此项研究，并已取得了一定的进展，如:Chang Yi Wang等［20］设计了包含有一个 Th细胞表位的口蹄疫多肽疫苗，并在猪的免疫保护实验中起到了有效的保护作用。Marchi等［21］曾报道，将串联有FMDV VP1第140～160和第200～213氨基酸残基的合成肽免疫牛后，动物能抵抗病毒的感染。但随后的研究证实，当将此类合成肽疫苗在易感动物群内大规模使用时，却仅能提供有限的保护［22］。究其原因，缺乏辅助性T细胞表位可能是影响该疫苗效果的一个因素。同时携带B细胞抗原表位A和T细胞抗原表位 (VP121～140)的串联合成肽已经被证明对牛表现出良好的免疫反应性。Zamorano等［23］用O型口蹄疫 VP1的135～160氨基酸残基上包含有T和B细胞优势表位免疫牛，产生了强烈的中和抗体反应，虽然135～144不能引发抗体反应，但其重复串联序列却可以诱导有效而且强烈的中和抗体反应。用腺病毒构建了含口蹄疫VP1的3个氨基酸残基表位 (21～60、141～160、200～213)的重组腺病毒 (rAd-GMCSF-VPe)，并与猪的巨噬细胞集落刺激因子混合接种豚鼠和猪，能检测到高水平的T细胞增殖、IL-4和IFN，并伴有特异性的体液免疫应答。构建的共表达FMDV复合多表位基因以及猪IL-18基因的非复制型重组鸡痘病毒疫苗vU-TA2-OAT以及DNA疫苗pVRI-OAT，将上述2种重组疫苗分别单独或联合接种豚鼠，测定FMDV特异性结合抗体、中和抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种重组疫苗均能诱导豚鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答，其中以pVRI-OAT/vUTA2-OAT的联合免疫方式的效果最好，其诱导的抗体水平接近于常规灭活疫苗，而细胞免疫水平则比后者高得多。

3 展望

大量的研究结果证实，要更加深入的研究FMDV的致病及免疫机理、设计构建更加安全有效的新型口蹄疫疫苗，需要尽最大可能地阐明针对FMD免疫的各类T细胞表位。只有包含有效的T细胞表位，设计出的新型FMD疫苗才能跟好的预防和控制FMD。相信随着各种技术的不断发展，对T细胞表位的研究方法将不断丰富和完善，对FMDV T细胞表位的认识也将不断深入，从而使FMDV的研究更加全面和深入。

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