多糖硫酸化修饰和硫酸酯多糖的抗病毒活性研究进展

金秧敏,王春花,王鑫滢,张秀英

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

病毒感染性疾病一直是威胁人类健康的世界性难题,也是动物常发的主要疾病。这是因为一方面病毒易发生多种变异,而且它们完全依赖感染的宿主细胞增殖和存活,另一方面作为抗病毒药物所必须具备的最重要的条件是对细胞内的病毒有抑制作用,而对细胞的正常代谢无影响使得开发有效的针对病毒感染的治疗制剂存在诸多困难,至今仍然没有有效治疗药物,目前多用核苷类似物用于病毒性疾病的治疗,然而这些药物存在诸多问题：对细胞的毒副作用,抗药变异株的出现,对与宿主细胞基因组整合的病毒以及对潜伏病毒感染的治疗有一定困难等[1]。总之抗病毒药物研究还未取得突破性进展。鉴于病毒感染危害的严重性和广泛性,人们更关注开发新的、具有不同作用机制、且毒副作用较小的抗病毒制剂。

多糖作为一类重要的天然生物活性物质,具有无细胞毒性且质量通过化学手段容易控制等优点,已成为当今新药的发展方向之一。但天然药物的药效相对较低,通过分子修饰的方法可以提高其功效。其中硫酸化修饰是近年来多糖结构修饰的重要方向之一。近年的研究已经证实,多种多糖经硫酸化修饰后,会使其具有或加强抗病毒活性。

1 多糖的硫酸化修饰方法

多糖的硫酸化反应原理是在路易斯碱溶液中由SO3 H+取代多糖羟基中的H+,经中和而得的多糖硫酸盐。主要方法有浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法,Nagasawa方法,氯磺酸-吡啶法和氯磺酸-甲酰胺法。浓硫酸法和三氧化硫-吡啶法由于其酯化程度和回收率不高,因此现在应用较少。

Nagasawa方法：呋喃型多糖常采用此法。多糖溶于二甲基亚砜中,加入哌啶-N-磺酸,混和物加热反应,再加入饱和碳酸氢钠溶液,透析,浓缩,冷冻干燥后即得硫酸酯化的呋喃型多糖。

氯磺酸-吡啶法：即Wolfrom 方法,用氯磺酸与吡啶的混合物作为硫酸酯化试剂对多糖进行硫酸酯化。此法试剂简单易得,反应条件相应地简单,产物回收方便,回收率和取代度均较理想。但是该试剂在冷藏下只保存一周,不过最好新鲜制备。

氯磺酸-甲酰胺法：此方法与氯磺酸-吡啶法类似,不同之处只是先将多糖溶解在甲酰胺中,这样有利于多糖的溶解,能提高硫酸酯多糖的回收率。

2 影响硫酸酯多糖抗病毒活性的主要因素

2.1 硫酸基团 硫酸基的引入会引起多糖理化性质,特别是立体构象的变化,而构象变化恰恰是活性变化的决定因素。研究发现,有的多糖本来无抗病毒活性,经硫酸化后表现出抗病毒活性,例如小分子量的牛膝多糖有增强免疫的作用,但无抗病毒活性,若引入一定量的硫酸基团后,就有较强的抑制乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表达以及抗单纯疱疹病毒I型的活性[2]。相反的,有抗病毒活性的硫酸酯多糖被脱去硫酸根后,即降低或失去抗病毒活性,例如,肝素钠N-脱硫酸化及O-脱硫酸化都会降低其抗病毒活性,说明其抗病毒活性不仅依赖于负电荷,而且特定的结构参与了抗病毒活性的生成,尤其是O-脱硫酸化显得极为重要[3]。

另一方面,硫酸基取代度,即每二糖单位中的硫酸基数量,是影响肝素等硫酸多糖抗病毒作用的一个重要因素。试验表明,多糖硫酸酯的作用与其取代度在一定范围内呈正相关[4],以D-葡萄糖和D-半乳糖为侧链的纤维素和支链纤维素硫酸酯化后,可表现出抗HIV活性,而且其抗HIV活性随硫酸基团取代度的增加而增强。一般来说,硫酸根含量在每个糖残基平均为1.5～2.0时最佳。

2.2 分子量 硫酸酯化多糖的抗病毒作用与分子量的大小有很大的关系。但不同多糖发挥抗病毒作用的最佳分子量各不相同,其抗病毒活性随着大于或小于该分子量而迅速降低。如硫酸葡聚糖抗HIV病毒活性随着相对分子质量的增加而增加,相对分子质量10 000时达到最大,在10 000～500 000之间保持最大活性,分子量再增加则其抗病毒活性将会下降[5]。右旋糖酐酯化后,其分子量在5 000～50 000之间时,抗 HIV活性随分子量增大而增强[6]。高分子量的硫酸多糖即使在比较高的浓度也没有表现出明显的细胞毒性,而对多种包膜病毒显示出其抗病毒活性;一般来说中等分子量多糖的抗病毒活性大于高分子量及低分子量的多糖。

2.3 化学结构 多糖经硫酸化修饰后,分子结构发生变化,其空间结构也发生变化,其抗病毒活性也会随之变化。沃尔默特认为,许多糖单位的氢基被SO-3基团取代后,糖环构象可能扭曲或转变并利于形成非共价键,而且带同性电荷基团间的相互排斥作用导致卷曲构象呈伸展和刚性状态。当多糖环被硫酸基修饰,这些阴离子基团间的排斥作用使糖链链段伸长;而且部分硫酸基可能会和糖环上的羧基形成氢键,因而在糖链局部可能形成了螺旋结构,呈有活性的高级构象,且有序性增大。因此,当多糖的结构发生变化时,其抗病毒活性发生相应的改变[7]。

3 硫酸酯化多糖的抗病毒作用

综合目前国内外研究来看,多糖对艾滋病病毒、疱疹病毒及流感病毒等具有良好的抑制作用,且具有活性的多为硫酸多糖。经人工硫酸化修饰可使原来不含有硫酸根或硫酸根含量低的多糖表现出较强的抗病毒活性[8]。

自1987年发现硫酸酯化葡聚糖具有抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)活性以来,人们对这类多聚阴离子化合物产生了极大兴趣和关注,特别是关于该类多糖的抗病毒研究十分活跃,它有可能成为继HIV逆转录酶活性抑制剂(RTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)和融合酶抑制剂(INIs)之后又一类潜在的新型抗HIV药物。

辛现良等[9]从南海多种海藻硫酸化多糖中筛选和分子修饰得到的聚甘古酯-海洋硫酸多糖911,其重均分子量为6 000,在体内外均可抑制HIV-1的增殖,是一种高效的新型抗HIV-1海洋药物。于囡等[10]从海洋贝类扇贝裙边中提取、纯化得到的酸性粘多糖(SS-GAG)-扇贝裙边糖胺聚糖具有很强的抗单纯疱疹病毒的作用。SS-GAG不同浓度均能有效保护经HSV-I感染的Vero细胞和宫颈癌(Hela)细胞,使细胞活性增强;并减弱HSV-I导致的细胞病变效应(CPE),抑制病毒的复制,阻断HSV-I对细胞的侵入,但没发现其对病毒的直接杀伤作用。卢宇等[11]从淫羊藿叶中分离纯化得到淫羊藿多糖,按正交试验设定氯磺酸-吡啶法的9种修饰条件,对淫羊藿多糖进行硫酸化修饰,得到9种硫酸化淫羊藿多糖,试验证明其抗鸡传染性腔上囊病毒的能力均有不同程度的提高,且其能力与硫酸基取代度和糖含量有一定的相关性。

4 硫酸酯多糖的抗病毒作用机制

一般认为,多糖的抗病毒机制是对病毒复制早期阶段进行抑制,有研究资料表明,硫酸酯化多糖的主要抗病毒机制可能是硫酸基团的负电荷与病毒上蛋白的正电荷通过静电作用结合,进而阻止了病毒对细胞的吸附,封闭了包膜病毒与细胞受体结合的部位。虽然病毒种类不同,但抗病毒的机制类似。

4.1 抗艾滋病病毒(HIV)的作用机制 硫酸酯多糖首先通过干扰HIV与宿主细胞的吸附而发挥作用。硫酸酯多糖是阴离子多聚体,带有负电荷,可与HIV-1的外壳糖蛋白gp120上带正电荷的的V3环区域结合,使病毒颗粒不能与CD4+细胞结合。另外由于它在结构上和细胞表面的糖胺聚糖相类似,能以竞争性抑制的方式来阻止病毒与细胞的结合,形成无感染的硫酸酯多糖-病毒复合物;同时它还是CD4+细胞表面分子的模拟配体,能够直接与T细胞表面受体结合,阻碍病毒与CD4+细胞的吸附过程[12]。

硫酸酯多糖的抗HIV病毒作用还可通过抑制逆转录酶活性来影响病毒的逆转录过程,已经有体外试验证明,硫酸酯化多糖能有效抑制HIV-1的逆转录酶活性,未硫酸化的多糖几乎没有这种作用。有学者认为,硫酸酯多糖分子中的硫酸化侧链与RNA模板引物上的某些酶具有相同的结合位点,从而产生竞争性抑制作用[13]。但究竟是通过何种机制来影响病毒的逆转录过程目前还不清楚,有待进一步的研究来阐明。

4.2 抗单纯疱疹病毒(HSV)的作用机制 对于HSV有报道认为硫酸酯化多糖可与HSV中的糖蛋白C(gC)竞争性的抑制细胞表面受体分子硫酸乙酰肝素(HS)[14],主要通过与病毒糖蛋白上带正电荷的富精氨酸区域结合来阻止病毒与细胞结合。主要是因为硫酸酯化多糖是一类多聚阴离子,带有负电荷能与病毒包膜糖蛋白上的正电荷结合,导致这些区域的屏蔽作用,从而阻止病毒与细胞结合。

4.3 抗流感病毒(IFV)的作用机制 硫酸酯多糖可阻止IFV中糖蛋白血凝素与宿主细胞膜表面多糖受体末端的N-乙酰神经氨酸结合,阻止使病毒附着于易感细胞表面[15]。廖灶辉等[16]从海洋藻类龙须菜中提取多糖,并证明龙须菜硫酸化多糖可以通过干扰病毒对宿主细胞的吸附,抑制病毒的复制实现其抗流感病毒的作用。且证明其抗病毒能力在硫酸根含量为13.25%,DS为1.16时其抗病毒作用最好。

5 硫酸酯多糖抗病毒作用的应用前景

随着对天然药物认识的不断加强,海洋药物抗病毒活性的研究越来越受国内外学者的关注。目前中国已从海洋有机体中提取了一种硫酸化多糖,即硫酸多聚甘露醛酸多糖(SPMG),作为用于治疗AIDS获得性免疫缺陷综合征,又称艾滋病的候选药物已经进入临床Ⅱ期试验阶段[5]。SPMG主要是通过其特殊位点与CD4分子阳性细胞结合,以此来介导在AIDS感染者中的抗病毒作用,有望不久后用于AIDS的治疗,为有效治AIDS发挥积极的作用。

硫酸酯化多糖作为新型抗病毒药物的研究已经取得了一定的进展,相信随着科学技术的进步、新研究方法的应用、对硫酸酯化多糖构效关系认识的加深以及对硫酸酯化多糖抗病毒作用机制的不断阐明,相信将有更多新的高活性低毒性的硫酸酯化多糖用于临床抗病毒治疗中。

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