人肠道病毒71型动物模型研究进展

刘江宁，张连峰，2

(1.中国医学科学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021;

2.中国医学科学院实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

人肠道病毒71型动物模型研究进展

刘江宁1，张连峰1，2

(1.中国医学科学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021;

2.中国医学科学院实验动物研究所，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

人肠道病毒71型是婴幼儿手足口病的致病原之一，其严重的并发症可导致神经系统疾病，甚至死亡，是近期威胁中国儿童健康的因素之一。目前尚无临床疫苗可以预防该病毒感染，而EV71的动物模型是进行致病机理、疫苗评价和药物等研究的基础。本文对EV71的两种常用动物模型:小鼠和猕猴(Macaca mulatta)模型进行了描述，并对其在研究中的应用给与概括，为研究者选择合适的动物模型提供了依据。

人肠道病毒71型;手足口病;模型，动物

1969年，研究者首次从患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离得到肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，Schmidt等［1］1974年鉴定。EV71病毒属于微小病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA病毒［2］。1974年以来，EV71病毒曾在世界范围内多次暴发，主要引起婴幼儿(0～6岁)手足口病(HFMD)和无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种与神经系统相关的疾病，而中枢神经系统感染导致的肺水肿、肺出血和心肌炎，使其致残和病死率较高。每次疫情暴发，均会夺走许多婴幼儿的生命［3］。到目前为止，临床上尚无预防EV71病毒感染的疫苗或针对性治疗药物，理想的动物模型是解决以上问题的关键之一，本综述对EV71病毒在中国的流行特点，现有的动物模型及其应用进行了概括。

1 EV71病毒流行特点及中国疫情

根据病毒的VP1基因序列，EV71可分为A、B和C三种基因型，包含A、B1－B5和C1－C5共11个亚型［4］。在1997～2005年马来西亚的暴发中，重症EV71感染以C1、C2、B3、B4和B5亚型为主［4］。在1999～2007年，澳大利亚的重症EV71感染以C1亚型为主［5］。2004年台湾首次出现了C4亚型毒株的流行，2006～2007年间，台湾的EV71暴发以B5和C5亚型为主［6］。而中国的EV71暴发主要以C4亚型为主，偶尔有C5亚型感染的报道［7］。EV71不同型毒株之间，在毒力方面并无明显差异，各种基因型的EV71均有引发严重症状的报道［8］。

1997年以来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势［4，6，7］。1981年，我国在上海发现手足口病，随后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东和安徽等十几个省(市)相继出现疫情。2008年EV71导致的手足口病疫情在多个省市暴发，2009年1～4月，全国累计报告手足口病例115 618例，重症773例，死亡50例，由于死亡的都是婴幼儿，引起很大的社会恐慌。李仁清等［9］分析了北京2006～2008年间的流行毒株的序列，发现北京地区流行的EV71仍然是C4亚型，并且在同一时期的不同地区、不同来源和不同疾病状态下分离的毒株在VP1序列上无明显差别。但是随着时间推移，核苷酸变异的不断积累，有出现新亚型毒株的可能。

2 EV71病毒的动物模型

2.1 小鼠模型

EV71感染的1日龄新生ICR或BALB/c小鼠是最为常见的EV71模型动物。临床分离毒株对肌肉组织的噬性高于脑组织，临床分离株经过小鼠体内扶强后，可以引发神经症状，甚至可以感染1周龄或两周龄的小鼠。

Chumakov等［10］使用B1亚型的保加利亚临床分离株感染1日龄的新生小鼠，可引发瘫痪和肌炎及肌纤维坏死。Arita等［11］将B1亚型的EV71毒株在NOD/SCID小鼠颅内传代扶强，分离到了一株NOD/SCID小鼠适应毒株，该毒株感染3～4周龄的NOD/SCID小鼠后，可以使其表现出后肢麻痹。

Chua等［12］将B3亚型的澳大利亚临床分离株在BALB/c小鼠颅内扶强，扶强后的毒株感染1～7日龄BALB/c小鼠，引发了严重的致死症状，骨骼肌是病毒的主要复制位点，病毒侵染引发严重的坏死性肌炎。Chan等［13］用B3和B4亚型的EV71作为出发毒株，建立了1日龄ICR小鼠的感染模型，对小鼠进行颅内病毒感染后，小鼠均出现明显的体重增长减缓，而B3亚型毒株感染2 d后可观察到嗜睡和运动不协调症状，部分小鼠四肢肿胀并伴随死亡，未发现后肢麻痹症状，而未死亡的小鼠在感染6 d后，上述症状全部消失，恢复正常。Chen等［14］用C2亚型的小鼠适应株通过灌胃感染1日龄的ICR小鼠，2 d后，小鼠可出现皮肤病变，一般在4～7 d后出现后肢麻痹，7～9 d后死亡，病理观察发现了脑部的淋巴细胞浸润。随后，Wang等［15］将上述C2亚型毒株在1日龄的ICR小鼠颅内4次传代扶强后，得到MP4菌株。扶强菌株在体内外的毒力均比出发菌株增强，且扶强后的毒株可通过灌胃法感染7日龄ICR小鼠，导致其后肢麻痹，并在5～9 d内死亡。病理观察到了感染小鼠的脑干与脊髓中神经元消失和凋亡，四肢肌肉大面积坏死。感染早期，可在小鼠的小肠内检测到病毒复制，而病毒的主要复制位点是在肌肉、脊髓与脑中。同时，MP4感染小鼠后，可发生同窝之间的交叉感染现象。

Ong等［16］使用B3亚型的小鼠适应株，通过灌胃与注射感染2周龄的ICR小鼠，小鼠感染后表现出脑脊髓炎等与人类似的神经症状，感染小鼠的前角神经元、三叉神经运动核和脑干网状结构的神经元中病毒数量最多，脑的其他部位也有少量的神经元被感染。该模型是迄今为止，能感染EV71病毒的年龄最大的正常小鼠。Wu等［17］将新分离的EV71的neu毒株在Vero细胞中进行两轮培养，得到YN3毒株，其通过腹腔感染新生ICR小鼠时表现出较高的毒力，可致新生的ICR小鼠后肢麻痹，最终死亡。

中国大陆地区的EV71流行株主要属于C4亚型，而实验动物普遍对该毒株不敏感，导致多数病毒株感染动物后，不能表现出明显的临床症状。朵建英等［18］通过腹腔注射对1日龄的ICR小鼠进行病毒感染，随后在脑、肺、骨骼肌与小肠中检测到了病毒复制，绘制了病毒在骨骼肌内的复制曲线，并联合组织的病理变化，建立了我国流行的C4亚型毒株的小鼠模型。

2.2 非人灵长类模型

口服EV71病毒不能使猕猴产生严重的神经症状，猕猴免疫与攻毒多使用椎管或静脉注射接种［19，20］。Chumakov等［10］使用保加利亚临床分离株感染猕猴之后，可使猕猴发生瘫痪，神经系统出现类似于脊髓灰质炎的病变。Nagata等［19］分别用5种EV71的临床分离株(患者分别患有脑炎，脑膜炎和手足口病)，通过椎管注射对猕猴(5～13岁，成年雌性)进行病毒感染，1～6 d后，猕猴均表现出了神经症状:迟缓性麻痹、震颤和共济失调，免疫组化证实了病毒在脊髓、脑干、小脑皮层、齿状核和大脑中的复制。随后，Nagata等［20］进一步建立了静脉注射感染猕猴的模型，猕猴(6～17岁，成年雌性)感染病毒后，具有与人脑炎类似的临床体征与神经病理表现，包括震颤、共济失调和脑水肿，但没有发生诸如肺水肿和心脏衰竭之类的神经源性并发症。值得注意的是，许多EV71病毒的临床分离株对猕猴感染时，表现出了较低的神经毒性［21］。国内未见使用猴建立感染模型的报道。

3 动物模型的应用

3.1 病毒在体内的传递及致病机制研究

病毒在体内的传播途径，是发病机制研究的焦点之一。Chen等［14］用C2亚型小鼠适应株通过灌胃感染小鼠，组织内病毒滴度实验表明，病毒首先在小肠内复制并引发病毒血症，随后依次传播到脊髓的胸段、颈段和脑干中，推测病毒利用逆向轴突的传递的方式进入脑内复制，这一点与脊髓灰质炎病毒类似。随后，Chen等［22］通过灌胃、肌内注射和颅内注射三种方式对7日龄小鼠进行感染后，均导致脑部感染、松弛型麻痹、肺功能失调和死亡。然而，不同的感染方式影响了疾病进展和发生神经症状的概率，与其他两种感染方式相比，颅内注射感染，可导致小鼠的死亡提前发生，表明从病毒接种到病毒传递到颅内的时间长短，决定了疾病发生的潜伏期长短。虽然灌胃感染可引发病毒血症，但是不引发明显的神经症状，预示着血液运输并不是病毒传递的主要方式。后肢感染病毒后，首先会在脊髓的腰段检测到病毒，随后传递到脊髓的颈段，最后抵达脑部;而上肢感染病毒后，则首先在脊髓的颈段检测到病毒，从而得出EV71病毒依赖神经元逆向传递的结论。Ong等［16］发现，通过肌内注射感染2周龄小鼠，病毒进入骨骼肌后，通过运动神经感染附近的中枢神经，并在中枢神经系统内传递。

关于EV71病毒的致病机理，目前尚不清楚。病毒感染引发的严重神经症状，普遍被认为是病毒在脑组织的复制引起的。然而，随后的解剖数据表明，许多患者体内的病毒复制与病变部位并不一致，并推测宿主免疫系统在发病过程中扮演了重要的角色［23］。Hashimoto等［24］用临床分离的毒株经皮下注射感染猕猴，结果一半的猕猴感染后表现出临床症状:后肢麻痹或衰弱。病理分析发现了神经系统和血管的病变，以及脊髓、延髓、大脑和脑干灰质中的神经元变性消失和炎细胞侵润。但是，在这些部位均未发现病毒复制，而血清中EV71抗体的浓度却显著升高，这预示着除了病毒复制以外，可能存在其他致病机制，如免疫过激或交叉免疫反应等［25］。

3.2 疫苗评价

预防EV71病毒感染的疫苗，均处于研究阶段，目前尚无临床上可以使用的疫苗。猕猴模型中，因为可以感染病毒的猕猴年龄较高，可以用做疫苗的自体免疫评价。Arita等［26］使用减毒的A型EV71病毒做为疫苗，对猕猴进行免疫，45 d后经静脉注射进行攻毒，免疫后的猕猴没有表现出症状，且其血清对不同亚型的EV71毒株(A、B1、B4、C2和C4)具有广谱性的中和作用。然而，从减毒毒株接种的猕猴脊索中，分离到了活病毒，表明弱毒株仍具有一定的神经侵染性，并引发了猕猴的震颤等微弱的神经症状。

由于小鼠对EV71病毒的敏感期较短，限制了其在疫苗评价中的使用。目前，国际上多采用对雌鼠或母鼠免疫，疫苗产生的抗体可以通过胎盘屏障传递给幼鼠，随后对幼鼠进行病毒感染，从而间接的评价母源抗体对幼鼠的保护作用。使用此类方法评价的疫苗，包括灭活的病毒、病毒结构类似物、VP1蛋白及VP1的DNA疫苗。Wu等［17］比较了灭活全病毒疫苗、VP1的DNA疫苗和VP1蛋白对雌鼠免疫后，母源抗体对幼鼠的保护能力。雌鼠经灭活病毒免疫后，再交配产下的的幼鼠，经2300LD50的病毒剂量感染时，存活率达到80%，而母鼠经VP1蛋白的DNA疫苗和VP1蛋白免疫后产下的的幼鼠，在230 LD50的病毒剂量感染时，存活率分别为40%和80%，指出灭活全病毒作为疫苗具有最佳的保护效果。Chung等［27］表达并纯化了EV71病毒类似物—VLP，VLP模仿了全病毒的形状、衣壳蛋白结构和蛋白组成。免疫后的BALB/c母鼠产下的幼鼠，在受到EV71病毒(1000 LD50)攻击时，存活率可以达到89%，其保护活性大于变性的VLP蛋白和热灭活的EV71病毒。

Ong等［28］使用2周龄ICR小鼠的感染模型，对甲醛灭活的全病毒疫苗进行了自体免疫评价。对1日龄的新生鼠进行初次免疫，7 d后进行加强免疫。加强免疫7 d后的幼鼠进行病毒感染，结果均未表现出症状，各组织也未检测到病毒。

3.3 药物筛选

抑制EV71病毒的药物研究，多处于细胞水平上，在动物模型中对于药物治疗效果进行验证的报道并不多见，概因为感染病毒的幼鼠存在年龄过低、感染周期短和不宜进行给药等缺点。Li等［29］对12～14 d的ICR小鼠进行腹腔注射感染病毒，感染后2 h开始腹腔注射利巴韦林药物，每日剂量为100 mg/(kg·bw)，持续给药9 d，发现利巴韦林可以通过抑制组织内的病毒复制，来降低小鼠在面临病毒感染时的发病率、致死率(致死率降低到30%)和麻痹后遗症。Liu等［30］研究了I型IFNs对病毒感染的幼鼠的治疗效果，对3日龄的ICR小鼠进行腹腔注射攻毒，感染2～3 d后注射地塞米松(I型IFNs的抑制剂)，会加剧临床症状，增加组织内病毒滴度。而在病毒感染前12 h注射IFN素的诱导剂，则会提高成活率和降低组织内病毒滴度。注射I型IFN的抗体，则会提高死亡率和组织内病毒滴度。并且，在感染病毒后的3 d内，连续3 d注射IFN－αA，则会使幼鼠存活。Weng等［31］发现，牛乳铁蛋白在小鼠体内具有抗病毒效果，它可以延缓麻痹，降低死亡率。但是治疗组的死亡率依然达到了70%，表明其体内治疗效果微弱。

4 展望

EV71病毒被认为是脊髓灰质炎病毒被扑灭后，目前最重要的嗜神经性肠道病毒。然而，由于该病毒的流行地区主要是经济不发达的亚太地区，不能引起发达国家的足够重视，导致其研究进展不够迅速。关于EV71病毒感染的致病机理，目前尚不清楚;没有临床上可以使用的疫苗和针对性治疗药物，使疫情在很长时间内难以得到缓解，而解决上述问题的关键，是建立理想的模型。猴模型虽然可以满足上述要求，但是价格昂贵，不适合大规模药物筛选研究;目前小鼠的感染年龄过低，感染周期短，限制了其在疫苗的自体免疫评价和药物筛选中的应用。而进一步提高可感染病毒的小鼠年龄，甚至建立成年小鼠的感染模型，有望解决上述问题。

中国大陆地区手足口病疫情的病源主要是C4亚型毒株，但是，该亚型的毒株对于实验动物普遍敏感性不高，导致目前尚未见可以使被感染动物发病，甚至死亡的模型报道。进一步提高病毒对动物的噬性，或改善动物对病毒的敏感性，有望解决这一问题。

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Hum an Enterovirus 71 Infection in Experim ental anim als

LIU Jiang－ning1，ZHANG Lian－feng1，2

(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical Collage(PUMC)，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine;Institute of Laboratory Animal Science，CAMS＆Comparative Medicine Centre，PUMC，Beijing 100021)

Human enterovirus 71(EV71)is one of the major pathogens causing hand，foot and mouth disease in children.The serious complications can lead to neurological symptoms and even death.EV71 is one of the factors threatening the health of Chinese children recently.However，there is currently no vaccine available to prevent clinical infection of this virus.As anim l models are the foundation for pathogenesis studies，vaccine and drug research on EV71 infection，in this paper，two commonly used animal model for EV71，mouse and rhesus monkey，are described and their applications in research are summarized.，to provide fundamentall information for researchers in selection of a suitable animal model.

Human Enterovirus 71;Hand，foot and mouth disease;Model，animal

R－322

A

1005－4847(2010)03－S5－05

2010－04－14

十一五传染病专项支持(2009ZX10004－402)。

刘江宁(1981－)，助理研究员，研究方向:传染病的动物模型。E－mail:ljn_zb03038@126.com

张连峰。E－mail:Zhanglf@cnilas.org