高脂饮食豚鼠高密度脂蛋白代谢的特点

陈慧敏，高南南，杨润梅，李金莲

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理研究中心，北京 100193)

研究报告

高脂饮食豚鼠高密度脂蛋白代谢的特点

陈慧敏，高南南，杨润梅，李金莲

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理研究中心，北京 100193)

目的研究豚鼠高脂饮食后高密度脂蛋白代谢的特点，并与大鼠进行比较。方法将豚鼠和大鼠分别随机分为正常组(NC)和高脂组(HF)，正常组均给予普通饲料，高脂组给予高脂饲料诱导10周后，测定血清LDL－C、HDL－C水平，HDL3/HDL2比值和LCAT、CETP的表达;采用real－time RT－PCR方法检测肝脏SR－BI表达的变化。结果与正常组相比，豚鼠高脂组血清HDL－C水平显著升高，高密度脂蛋白亚型HDL3/HDL2的比值升高，血清CETP表达均显著增加，血清LCAT表达下降，肝脏SR－BI mRNA表达水平是正常组的2.27倍。而相同高脂饲料条件下，大鼠的上述指标均无明显变化。结论豚鼠摄入高脂饮食后HDL代谢与大鼠有所不同，主要表现为血清HDL－C升高，肝脏SR－BI受体表达增加，高密度脂蛋白亚型组分发生变化，大颗粒HDL2含量相对减少，小颗粒HDL3堆积，其机制与血清CETP、LCAT的变化密切相关。

豚鼠;高密度脂蛋白亚型;卵磷脂胆固醇酰基转移酶;胆固醇酯转移蛋白;B族Ⅰ型清道夫受体

图1 豚鼠SR-BI 基因扩增产物溶解曲线Fig.1The dissociation curves of the guinea Pig SR-BI gene PCR Products

豚鼠的脂代谢生理特征、对饮食性胆固醇和药物治疗的反应性等方面都与人类存在许多相似之处，是一种比较理想的研究高脂血症和动脉粥样硬化的模型动物［1－4］。我们在实验中发现，通过高胆固醇高脂肪饮食诱导豚鼠形成典型的高脂血症和动脉粥样硬化病变时，其血浆高密度脂蛋白－胆固醇(HDL－C)水平也明显升高［4］，这一点与大鼠等动物的HDL－C变化有所不同。

高密度脂蛋白(HDL)是颗粒大小、组成和功能不均一的一类脂蛋白，其亚型HDL2和HDL3的相对含量、颗粒大小与高脂血症和动脉粥样硬化的发生发展密切相关［5］。胆固醇酯转移蛋白(CETP)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)和B类I型清道夫受体(SRBI)与HDL的代谢密切相关。本文采用高脂饲料诱导豚鼠形成脂代谢紊乱病变，检测血清LDL－C、HDLC水平、HDL亚型HDL3/HDL2比值及与其代谢相关的酶和受体的变化，同时与大鼠模型进行比较，探讨豚鼠HDL代谢特点及影响机制。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性Hartley豚鼠，体重230～250 g，来源于北京科宇动物养殖中心【SCXK(京)2007－0003】。雄性Wistar大鼠，体重210～230 g，来源于中国医学科学院医学实验动物研究所【SCXK(京)2008－0013】。

1.2 饲料

高脂饲料配方:0.5%胆固醇、10%猪油，89.5%基础饲料。高脂饲料和常规饲料均由中国医学科学院实验动物研究所营养部提供及加工制作【SCXK (京)2006－0003】。

1.3 主要试剂及仪器

直接低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)，批号: 090221;直接高密度脂蛋白胆固醇(HDL－C)，批号: 090291，均为中生北控生物科技股份有限公司产品。大鼠和豚鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)、高密度脂蛋白2(HDL2)和高密度脂蛋白3(HDL3)酶联免疫试剂盒，由上海朗顿生物科技有限公司提供(ADL)。TRIzol○Rreagent， Invitrogen(USA);反转录试剂盒:PrimeScriptTMRT reagent Kit，TakaRa(Japan);PCR试剂盒:SYBR○RPremix Ex TaqTM，TakaRa(Japan)。7060型全自动生化分析仪，日本日立公司;凝胶成像仪:Gel Doc XR and ChemiDoc XRS systems，Bio－RAD(USA);荧光定量PCR仪:Bio－RAD IQ5 multicolor real－time PCR detection system(USA)。

1.4 方法

上述动物适应性喂养一周后，将豚鼠和大鼠分别随机分为正常(NC)和高脂模型组(HF)，每组10只。正常对照组饲常规饲料，高脂模型组饲高脂饲料。连续饲养10周后股动脉取血，离心分离血清，按试剂盒说明操作，酶法测定血清LDL－C、HDL－C水平，酶联免疫吸附法测定血清HDL2、HDL3、LCAT和CETP含量。取血后脱颈处死，解剖取肝脏，－80℃保存，用于检测肝脏SR－BI基因表达的变化。

1.4.1 豚鼠SR－BI引物设计:根据GenBank中已发表的人类(NM005505)、日本大耳兔(NM001082788)、大鼠(NM031541)和小鼠(NM016741)的基因序列，运用同源性分析软件MGEA进行序列比对分析，在不同的外显子上设计豚鼠SR－BI基因的引物。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.2 Real－time PCR:用Trizol试剂提取肝脏组织总RNA，按反转录试剂盒说明书反转成单链cDNA，进行实时定量PCR分析。Real－time PCR反应体系按照PCR试剂盒配置，PCR的引物序列、扩增片段长度和退火温度见表1。PCR反应条件如: 95℃预变性30 s;95℃变性5 s;退57℃(依引物而定)30 s;40个循环。扩增结束后，将PCR产物以0.5℃/s程序性升温至95℃，实时荧光定量PCR仪自动绘制溶解曲线。选取任意cDNA样本制作各检测基因的标准曲线，判断扩增效率。

表1 PCR引物序列及参数Tab.1The sequences and parameters of the PCR primers

1.5 数据处理

血清LDL－C、HDL－C、HDL3/HDL2比值、LCAT和CETP的实验数据采用SPSS 15.0软件进行统计，以平均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，显著水平为P＜0.05。基因表达的数据使用基因表达相对定量软件REST©进行数据分析［6］，显著水平为P＜0.05。

2 结果

2.1 血清LDL-C、HDL-C水平和HDL3/HDL2比值

高脂饲料诱导10周后豚鼠血清LDL－C水平显著升高(P＜0.01)，与正常组比较升高7.80倍;大鼠LDL－C水平较正常组升高1.48倍(P＜0.05)。豚鼠高脂组血清HDL－C水平亦显著性升高(P＜0.01)，是正常组10.75倍，进一步对HDL的亚型组成进行测定，豚鼠高脂组HDL3/HDL2比值为(4.48 ±0.70)，较对照组(HDL3/HDL2=3.82±0.31)明显升高(P＜0.05)。相同高脂饲料诱导的大鼠血清HDL－C水平及高密度脂蛋白亚型HDL3/HDL2比值均无明显变化(表2)。

表2 豚鼠血清LDL－C、HDL－C、CETP、LCAT含量和HDL3/HDL2比值的变化(¯x±s)Tab.2Changes of serum LDL－C，HDL－C，CETP，LCAT concentrations and HDL3/HDL2ratio in the guinea pigs(¯x±s)

2.2 血清CETP和LCAT的表达

与正常组比较，豚鼠高脂组血清CETP含量显著升高(P＜0.01)，LCAT含量下降(P＜0.05);大鼠高脂组血清CETP和LCAT的含量较正常组均无明显变化(表2)。

2.3 肝脏SR-BI的表达

2.3.1 豚鼠SR－BI基因扩增特异性:SYBR I荧光染料的实时定量反应的特异性是通过分析PCR产物的溶解曲线来实现的。实验结果表明，豚鼠SRBI引物能在50℃退火时能特异的扩增出Tm约为87.0℃(预测Tm为87.0℃)的单一产物(图1，彩插4)，且扩增产物的溶解曲线为单一主峰，说明无引物二聚体和非特异性扩增。同时，琼脂糖电泳上可清晰看到单一的扩增条带，长约143 bp(图2)。

2.3.2 肝脏SR－BI mRNA表达变化:通过real－time PCR进行SR－BI mRNA的相对表达分析，高脂组豚鼠肝脏SR－BI mRNA表达水平显著升高(P＜0.01)，是正常组的2.27倍，而相同高脂饮食大鼠肝脏的SR－BI mRNA表达与正常组无明显变化(图3)。

3 讨论

图2 豚鼠SR－BI基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图谱Fig.2PCR products of the guinea pig SR－BI cDNA

实验结果表明，豚鼠正常组血清LDL－C水平较HDL－C高，具有较高的LDL－C/HDL－C比例(LDL－C/ HDL－C=2.8)，说明豚鼠血浆胆固醇主要通过LDL进行转运，这一点与人极为相似［1］。而大鼠正常组LDL－C/HDL－C比值仅为0.23，说明其胆固醇主要是由HDL携带转运。豚鼠经高脂饲料诱导后，除血清LDL－C明显升高外，HDL－C水平也明显升高，而大鼠经相同高脂饲料诱导后，血清LDL－C升高，但HDL－C变化则不明显。说明两种动物摄入外源性胆固醇后，其HDL－C的变化是不同的，这主要是由于它们的血浆脂蛋白的构成、对胆固醇反应的生理机制有所不同。豚鼠血清HDL－C明显升高，可能是为了清除血清过多的胆固醇酯，而对高胆固醇膳食的一种代偿性反应。而大鼠HDL－C变化不明显，可能是已具有HDL－C/LDL－C高比值水平(HDL－C/ LDL－C=3.35)，对外源性胆固醇未出现HDL－C代偿性升高反应。

注:与正常组相比，**P＜0.01图3豚鼠和大鼠肝脏SR－BI基因的相对表达Note:Compared with the control group，**P＜0.01Fig.3 Relative SR－BI mRNA expression in the liver of the guinea pigs and rats

B类Ⅰ型清道夫受体(SR－BI)是高密度脂蛋白代谢的受体，主要表达于肝脏和类固醇源性组织等，能介导胆固醇的选择性吸收［7］。本研究根据人、兔、大鼠等物种的SR－BI基因序列，设计豚鼠SR－BI基因表达的引物，首次证实了豚鼠肝脏存在SR－BI基因，同时对高脂饲料诱导下两种啮齿类动物肝脏SR－BI的变化进行了初步的研究。结果表明，大鼠和豚鼠给予相同的高脂饲料后肝脏SR－BI的变化不相同，豚鼠肝脏SR－BI基因表达增加，而大鼠变化则不明显。豚鼠肝脏SR－BI表达增加的原因是豚鼠在高脂饲料诱导下，血清HDL－C水平明显升高，由此刺激了肝脏SR－BI表达增加。相比而言，大鼠的血浆脂蛋白构成以HDL为主，大部分的胆固醇是由HDL携带经肝脏SR－BI代谢［8］，因此大鼠肝脏SRBI对HDL代谢能力较豚鼠和人类强。当大鼠摄入高脂饲料后，SR－BI对携带有外源性胆固醇的HDL能完全代谢，因此其血清HDL－C水平及肝脏SR－BI表达均未出现明显变化。

高密度脂蛋白可分为两个大的亚型，即大颗粒的HDL2(1.063～1.125 kg/L)和小颗粒的HDL31.125～1.210 kg/L)。HDL3含有少量的apoA－I和极性脂质，主要介导细胞胆固醇的流出，HDL2含有较多的apoA－I和胆固醇酯，与细胞胆固醇的酯化、转运及清除有关。新生的HDL作为胆固醇的接受体可介导外周组织多余的胆固醇流出，在卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的酯化下依次形成小颗粒HDL3和大颗粒HDL2，HDL2所含的胆固醇酯可经SR－BI受体选择性摄入肝脏代谢。当小颗粒的HDL3转变成大颗粒HDL2受阻时，外周胆固醇则不能有效的转运至肝脏进行代谢。因此，高密度脂蛋白亚型组成分析比单纯的HDL－C含量的变化更能说明高密度脂蛋白代谢的真实状态。我们的研究发现，大鼠和豚鼠经高脂饲料诱导后高密度脂蛋白亚型的组成发生了不同的变化。豚鼠的HDL3/HDL2比值增大，说明豚鼠血清HDL颗粒呈现出变小的趋势，大颗粒的HDL2含量相对下降，小颗粒的HDL3堆积，HDL携带外周胆固醇至肝脏代谢的能力减弱。与豚鼠不同，大鼠经高脂饲料诱导后高密度脂蛋白亚型HDL3/HDL2比值与对照组比较无明显改变。豚鼠高脂组血清HDL亚型组成的变化与HDL代谢的相关酶的活性变化有关。

LCAT的主要作用是催化HDL的游离胆固醇酯化，促使HDL由pre β－HDL、HDL3向HDL2的转变和成熟［9］。LCAT活性的变化将导致高密度脂蛋白亚型组成发生变化，当LCAT活性下降时，小颗粒的HDL3含量明显增加，而大颗粒的HDL2含量明显减少。本实验中豚鼠高脂组血清LCAT的含量下降，其催化HDL胆固醇酯化的速率降低，导致HDL成熟过程受阻，血中小颗粒的HDL3堆积，而大颗粒的HDL2的含量相对减少，可能是豚鼠HDL3/HDL2比值升高的原因之一。

文献报道，豚鼠血浆胆固醇酯转移蛋白(CETP)转运活性相当于人类的49%，而大鼠仅为人类的14%［10］。本实验中豚鼠正常组较大鼠正常组的CETP含量高，与文献报道一致。高CETP活性的动物(如豚鼠和人)大部分的HDL－C是通过CETP进行脂交换，而低CETP活性的动物(如大鼠)，HDL－C主要通过SR－BI直接代谢［8］。CETP可将HDL2中的胆固醇酯转移至极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)，并将VLDL和LDL中的甘油三酯(TG)转运至HDL2，这种富含TG的HDL2极易被肝脂酶(HL)识别并分解，使大颗粒的HDL2转变为小颗粒的HDL3，造成HDL2含量相对减少，而HDL3堆积［11］。豚鼠高脂组血清CETP含量显著增加，促进了HDL2向HDL3转变，导致血中大颗粒的HDL2水平相对降低，从而改变了血清HDL亚型的组成，因此高含量CETP是造成豚鼠HDL3/HDL2比值增加的另一机制。

本实验通过与大鼠比较，研究了豚鼠高脂饮食诱导后HDL代谢的特点。其结果表明，豚鼠经高脂饮食后血清HDL－C升高，肝脏HDL的受体SR－BI表达增加，HDL亚型HDL3/HDL2升高，表现为大颗粒HDL2含量减少，而小颗粒的HDL3堆积，与大鼠存在明显的区别，其机制与血清CETP、LCAT的变化密切相关。我们的研究结果为豚鼠、大鼠两种啮齿类动物经高脂膳食诱导后高密度脂蛋白的变化及其机制的阐明提供了一定的科学依据，也为豚鼠高脂血症及动脉粥样硬化模型应用于人类HDL代谢和相关药物的研究提供了一定的参考。

(本文图1见彩插4。)

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Characteristics of High Density Lipoprotein Metabolism in High Fat Diet-Fed Guinea Pigs

CHEN Hui－min，GAO Nan－nan，YANG Run－mei，LI Jin－lian

(Research Center for Pharmacology and Toxicology，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

ObjectiveTo study the characteristics of high density lipoprotein metabolism in guinea pigs fed with high fat diet，and compared with that in rats.MethodsHealthy adult male guinea pigs and rats were randomly divided into normal control groups(NC)and high－fat groups(HF)(n=10)，10 animals each，respectively.The NC groups were fed with normal forage，while the HF groups were given high fat diet(common forage plus 0.5%cholesterol and 10%lard)for 10 weeks.Blood samples were collected and the serum LDL－C，HDL－C levels，HDL3/HDL2ratio and CETP，LCAT concentrations were measured.The the hepatic relative expression of SR－BI mRNA was detected by real－time PCR.ResultsCompared with the control group，the serum HDL－C level，HDL3/HDL2ratio and CETP concentration in the guinea pigs of high－fat group were elevated significantly，LCAT was decreased(P＜0.05)，and the relative expression of hepatic SR－BI mRNA was 2.27 times high as that of the control group(P＜0.01).However，there were no significant differences between those indexes in the rats of control and high－fat groups.ConlusionThere are distinct differences in HDL metabolism between guinea pigs and rats when fed with high－fat diet.The serum HDL－C level and the expression of hepatic SR－BI are increased，the HDL subclasses are changed with a relative decrease of large－sized HDL2particles and accumulation of smallsized HDL3in the guinea pig，and its mechanisms are closely related to the changes of serum CETP and LCAT concentration.

Guinea pig;SR－BI;HDL subclasses;LCAT;CETP

R589.2

A

1005－4847(2010)03－0199－05

2009－10－12

科技部“重大新药创制”科技重大专项—综合性新药研究开发技术大平台—创新药物研究开发技术平台建设(2009ZX09301－003)。

陈慧敏，女，硕士研究生，研究方向:中药药理学。

高南南，女，教授，研究方向:中药药理学。E－mail:gaonann@126.com