细菌耐药性分子机制的研究进展

夏永祥,陈 杰

(南京医科大学附属南京第一医院,江苏南京210006)

目前,感染性疾病的治疗主要依赖于抗菌药物。然而,随着抗菌药物的广泛应用,细菌耐药性日益引起关注。2001年,我国重症监护室从患者体内分离的金黄色葡萄球菌对青霉素、庆大霉素、红霉素、环丙沙星、氯霉素和四环素的耐药性分别达99.5%,67.7%,84.7%,76.0%,34.0%和64.8%[1]。同时,多重耐药菌的出现,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、革兰阴性杆菌中产生超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌[2]、青霉素耐药肺炎链球菌和万古霉素耐药肠球菌等,对人类健康也形成了较大的威胁。耐药细菌对人类健康构成的威胁已经不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病[3]。细菌耐药性是全世界所面临的重大挑战,各国都在致力于对耐药细菌的研究。本文就细菌耐药性产生的分子学机制进行概述。

1 概述

1.1有关概念除了细菌会产生耐药性外,真菌、支原体等微生物也存在耐药性问题。这里主要讲细菌。抗生素是抗感染药物最重要的一类,其含义较狭窄。这里使用“抗生素”代表“抗菌药物”、“抗微生物药物”、“抗感染药物”等概念。消毒剂也属于药物,但一般只用于环境和物品的药剂;而抗生素用于人体,通过血液吸收和运输而发挥作用。细菌的耐药性包括对这两大类与之作用的药剂的耐药性和抗性。“耐药性”常用于抗生素,“抗性”常用于消毒剂。本文统一使用“耐药性”,因其本质含义是一致的。细菌对某抗生素或消毒剂的耐药性也可以简述为某抗生素或消毒剂耐药。

1.2细菌耐药性普遍存在流行病学调查不仅在医院临床,而且在社区,细菌耐药性普遍地存在,并且有的地区社区的耐药性要比医院内高。药物对耐药菌的临床疗效降低或无效,对感染性疾病尤其是危重症感染患者构成威胁[4]。随之而来的是,为治疗耐药性细菌感染的花费不断增长,美国每年治疗耐药性细菌感染费用为40多亿美元[5]。人类正面临着“抗生素危机”,有人预测会出现“无药可用”的可怕局面。耐药性的发展趋势,从细菌来讲,呈现单一耐药到多重耐药趋势;从药物来讲,呈现低耐药率到高耐药率的趋势;发展速度是越来越快。以对喹诺酮类药物的耐药性为例,1995年北京地区临床分离的菌株,大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌对诺氟沙星耐药率分别为32%和32%,对环丙沙星耐药率分别为58%和49%[6]。1996年武汉地区大肠埃希菌对环丙沙星耐药率达44%[7]。1997年上海瑞金医院报道大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药率已超过50%[8]。1997年解放军总医院报道大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率从1994年的41.9%上升至1997年达60.4%[9],可见其耐药发展之快。目前,耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、产超广谱β-内酰胺酶(ESBL s)的革兰阴性杆菌、持续高产I型β-内酰胺酶(Amp C)的革兰阳性杆菌的耐药问题是非常突出的[10]。

1.3耐药性产生的主要外因抗生素在感染性疾病的治疗上发挥着重要作用,但由于各种因素使得抗生素使用的规范被忽视,导致抗生素被滥用。现在各种药店和商场可以随意购买抗生素;在饲料中加抗生素也很常见。随着滥用越来越严重和普遍,细菌耐药性也越来越严重和普遍;而且细菌的多重耐药性增加、致病力增强。虽然人类可以生产更多更新的抗生素来对付细菌,但细菌产生耐药性的变异速度更惊人(几小时或几天),而生产一种新抗生素从研究到临床使用至少需要几年。滥用抗生素越严重,细菌的变异速度和适应能力也就越发展。同时,人们卫生观念的“提高”,使消毒剂的不合理应用也日益严重,更加重了细菌耐药的状况。这些情况可以称之为选择性压力[11]。

2 遗传学机制

2.1染色体介导的耐药染色体介导的耐药,是指细菌本身所固有的耐药性或通过染色体突变产生的耐药性。这种耐药性的产生受细菌染色体DNA的控制,是同属细菌的共同特征,如肠球菌耐头孢菌素类药物。这些细菌耐药性的产生是细菌细胞所固有的,与细菌的遗传和进化密切相关。微生物在遗传进化过程中,普遍存在自发基因突变的现象,其结果可以导致细菌某些表型和功能的丧失,或获得新的功能,以对抗抗生素的作用。对于耐药性而言,如果编码抗菌药物作用靶位的核苷酸发生点突变,导致转录的靶位蛋白空间构象发生改变,其物理化学性质也可以随之发生变化,结果使药物与靶位之间的结合力下降或丧失,而使细菌产生耐药性。

2.2质粒介导的耐药为获得性耐药,并且所获得的耐药基因易于传播。目前该类耐药在临床上占有重要地位。质粒是位于细菌染色体之外的具有自主复制能力的一种环状DNA,长度在10 kb-1000kb之间。其编码的基因功能并不是宿主细胞生长所必须的,但可以赋予细菌某种表型,其中耐药性就是典型的例子。质粒可以通过接合或转导作用在不同的细菌之间进行转移。目前,发现最多的是质粒介导的对抗生素具有较强水解作用的AmpC酶(AmpCβ-lactamase)、超广谱 β-内酰胺酶(extended-spectrum βlactamases,ESBLs)和碳青霉烯酶等[12]。在有的医院现在已经发现在一个质粒上含有ESBLs和AmpC酶,称为超超广谱β-内酰胺酶(Super-spectrum β-Lactamase,SSBL)[13]。到2002年已报道的质粒AmpC类头孢菌素酶就有20多种,并且呈世界性分布[14]。

2.3转座子介导的耐药性转座子(transposon,Tn)又名跳跃基因,一种比质粒更小的DNA片段,它可以在染色体中跳跃移动,或在同一细胞中的染色体与质粒间移动,通常通过复制插入到新的位点,也可以将自身从原位点剪切掉再插入到新的位点,使结构基因的产物大量增加,从而使宿主细胞失去对抗菌药物的敏感性。Tn还可以使位于染色体上和非接合质粒上的基因转移到接合质粒中,因此实现细菌间的基因转移或交换。在细菌对万古霉素(Van)的耐药性机制研究中发现vanA基因存在于Tn1546中。这一转座子含有9个基因,其中包括2个编码万古霉素耐药基因的“vanA基因簇”[15-16]。有些情况下,耐药基因的转移以转座子、整合子和质粒等可移动的遗传元件介导,易于传播也常见。整合子是近年来发现的新的可移动基因元件,可捕获和整合细菌的耐药基因,在细菌耐药性的传播和扩散中起到了至关重要的作用。整合子可在不同细菌中水平传播,在同一类整合子上可携带不同的耐药基因盒,同一个耐药基因又可出现在不同的整合子上。细菌的耐药基因可以在在不同的整合子中移动,介导多重耐药的形成[17]。

3 生物化学机制

3.1产生灭活酶或钝化酶细菌可以产生灭活酶或钝化酶来灭活或修饰进入细菌细胞内的抗菌物质,使之失去活性。如肠杆菌可携带ereA基因和ereB基因表达红霉素酯酶使红霉素酯解失活,由mphA,mphB和mphC基因编码的红霉素磷酸转移酶,其表达产物可使红霉素脱氧二甲胺己糖C-2′位置发生磷酸化或糖基化而失活[18]。细菌对氨基糖苷类抗生素耐药性主要是由于细菌产生的氨基糖苷类修饰酶(Aminoglycosides modifying enzymes,AME)对抗菌药物分子中某些抗菌活性所必需的基团进行修饰,使其与作用靶位核糖体的亲和力大为降低而出现耐药性。1983年分离到的大多数耐药菌仅对某一类氨基糖苷类抗生素产生耐药,而最近调查发现大多数的耐药菌含有多重耐药机制,其中最多的含有6种AME[19]。

3.2对抗菌药物的渗透障碍由于细菌细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变,抗生素无法进入细胞内到达作用靶位而发挥抗菌效能。细菌通过胞外膜通透性的下降,而阻碍抗生素进入细菌内膜的靶位,减少抗生素吸收。革兰氏阴性菌膜通透能力变化较大,在抗生素的压力下膜孔蛋白通道变得非常狭窄,从而对大分子化合物的穿透形成有效屏障。亚胺培南等抗菌药物需穿透铜绿假单胞菌细胞膜上的微孔方能到达作用的靶位。当铜绿假单胞菌编码微孔蛋白的oprD2基因发生缺失突变时,细胞膜上微孔缺失,亚胺培南无法进入胞内而失去作用[18]。

3.3主动外输机制铜绿假单胞菌对多种常用的抗生素耐药,主要是由于其外膜存在着独特的药物泵出系统,可以将进入胞内的药物泵出胞外而致耐药[18]。药物外输机制是微生物对药物产生耐药性的又一个重要机制,它是由药物外输泵来完成的。药物外输泵是一类位于细胞膜上的由内膜转运蛋白、内膜融合蛋白及外膜通道蛋白一起形成的功能性膜转运蛋白质[20]。其作用机理是当细胞内的药物浓度聚集到一定程度,药物外输泵系统相关mRNA的表达增加,结果使细胞膜上外输泵的数量增加,使细胞内的药物被泵出,从而使菌体内药物浓度降低而导致耐药[21]。外输系统可能是细菌在进化过程中形成的一种细胞自身解毒系统,在细菌基因组中,一般都存在外输系统的调节基因。

3.4作用靶位的改变作用靶位改变后会使抗生素失去作用位点。靶位的改变包括亲和力降低和替代性途径的取代作用,可通过产生诱导酶对菌体成分(抗生素的作用靶位)进行化学修饰,或通过基因突变造成靶位变异而引起[22]。喹诺酮类的作用靶位有2个,DNA旋转酶及拓扑异构酶Ⅳ,两者均参与DNA的复制。对于结核分支杆菌缺乏拓扑异构酶Ⅳ,只有DNA旋转酶一个靶位。对于2个靶位的作用强度,革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌不同,对于大肠埃希菌等革兰氏阴性菌,环丙沙星等品种的主要作用靶位为DNA旋转酶,次要靶位为拓扑异构酶;对于葡萄球菌等革兰氏阳性菌,环丙沙星等品种的主要作用靶位为拓扑异构酶,次要靶位为DNA旋转酶。细菌对喹诺酮类的敏感性由主要作用靶位决定,主要靶位的点突变可引起细菌对喹诺酮类敏感性的降低,多个点突变或同时存在次要靶位的突变使耐药程度进一步上升[23]。

3.5细菌产生抗菌药物的颉颃物细菌可以通过代谢颉颃剂产量的增加来抑制抗生素,从而获得耐药性。有些细菌能利用一定的酶系统(如二氢叶酸合成酶等),把对氨基苯甲(paminobenzoate,PABA)合成为它们生活所必需的叶酸,以维持自身的生长需要。由于磺胺类药物在化学结构上与对氨基苯甲酸极为相似,当两者同时存在,磺胺类药物浓度较高时,即可深入细菌体内竞争二氢叶酸合成酶,生成异常的核酸拟似物,使细菌不能生成菌体所必需核酸而死亡。然而对磺胺类药物产生耐药性的细菌,可通过调整代谢环节,产生大量的对氨基苯甲酸,抵消磺胺药对酶的竞争,从而使药物失去抑菌作用[24]。耐药金黄色葡萄球菌通过增加20倍-100倍的对氨基苯甲酸产量,从而耐受磺胺类药物的作用[25]。

3.6生物被膜的形成细菌生物膜(bacterial biofilm)是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的胞外基质组成,它能够阻止药物渗透到细菌细胞内。铜绿假单胞杆菌形成的生物膜是近几年来引起国内外许多学者高度重视的一种细菌群体性生物学特征。生物膜的多细胞结构可以在不同时间和空间发展,容易受外界环境影响[19]。当细菌吸附于活性固体表面时它能够分泌胞外多聚物形成生物膜,生物膜具有极强的黏附性和耐药性,能够抵抗百倍以上的正常剂量的药物。细菌的遗传性耐药水平较高,则形成生物膜的能力较弱。原因可能是耐药水平较高的细菌本身对药物就不敏感,因此药物不易诱导细菌形成生物膜;相反,药物敏感株却容易被诱导形成生物膜,加大对药物的耐受程度。所以,细菌生物膜的形成有可能是被药物诱导的,而且细菌耐药水平越高形成生物膜的能力就相对较弱[26]。总之,生物膜形成发展的基础研究还存在很多困扰问题,需要进一步深入。

3.7细菌代谢状态的改变呈休眠状态的细菌,或细菌营养缺陷菌均可出现对多种抗生素耐药。

4 防止细菌产生耐药性初步构想

细菌耐药性的产生机制极为复杂,一个耐药菌株对同一种药物可同时具有多种耐药机制;同时,一个耐药菌株也可同时具有多种耐药基因,而引起对多种药物同时耐受,所以控制和减少耐药性细菌的产生已成为摆在人们面前的一个严峻问题。为了防止细菌耐药性的产生,可以采取以下几种措施:(1)有效控制抗生素的使用。合理用药,最大限度地减少细菌的选择性压力,严格控制抗生素药物用于预防感染,调整抗生素的应用结构,控制新型抗生素的应用。(2)减少抗生素在人畜中的使用。在食品动物中使用抗生素与病原菌出现耐药性之间有一定的联系,这些耐药性病原菌进入食物链后会影响人和动物的健康,所以应该开发动物用药指南,减少抗生素在食用动物中的滥用和误用。(3)开发治疗感染的非抗菌素类新药。开发作为人类天然抵抗感染的抗菌肽。(4)促进疫苗的研发,鼓励开发新的特异性强的疫苗。

[1]马 越,李景云,姚 蕾,等.住院患者分离的金黄葡萄球菌耐药率比较分析[J].中华医学杂志,2003,83(5):382.

[2]肖春玲,姚天爵.细菌耐药性与新抗菌药物的研究[J].中国医学科学院学报,2004,26(4):351.

[3]张永标,张扣兴,唐英春,等.产质粒介导AmpC酶和 ESBL s细菌的耐药性及β-内酰胺酶基因型研究[J].中华微生物和免疫学杂志,2004,24(7):577.

[4]Murray BENew aspectsof antimicrobial resistance andthe resulting therapeutic dilemmas[J].J Infect D is,1991,163:1185.

[5]金伟华.全世界细菌抗药性呈上升趋势[J].国外药讯,1996,2:32.

[6]张凤凯,金少鸿,吴 钰,等.北京地区部分医院细菌对常用抗生素耐药现状及变迁[J].中华医学杂志,1997,77(5):327.

[7]申正义,孙自锋,王洪波.武汉地区临床分离菌耐药性监测[J].中华内科杂志,1998,37(3):440.

[8]倪语星,乔静贤,项明洁,等.上海瑞金医院1887株临床分离菌耐药性分析[J].中华医学检验杂志,1998,21(2):102.

[9]张军民,吴 坚,赵利萍,等.大肠埃希菌耐环丙沙星gyrA基因突变的研究[J].中华医学检验杂志,1998,21(3):158.

[10]陈民钧.细菌耐药性及其临床意义[J].中华外科杂志,1998,36(增刊):6.

[11]Fred C,Enover PhD,JamesM.The challenges of emerging infectious dis-ease-development and spread of multiply-resistant bacterial pathogens[J].JAMA,1996,15(4):199.

[12]王 辉,刘颖梅,王清涛,等.北京发现同时产DHA-1质粒AmpC型及CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25(5):419.

[13]王 辉,刘颖梅,王清涛,等.北京发现同时产DHA-1质粒AmpC型及CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25(5):419.

[14]Alain P,Arlet G,Jacoby G A.Plasmid-determined AmpC-type-lactamase[J].Antimicrob Agents and Chemother,2002,46(1):1.

[15]戈 梅,罗敏玉,陈代杰.细菌对MLS类和糖肽类抗生素产生耐药性的作用机制[J].中国新药杂志,2005,14(3):282.

[16]Markiewicz S K.Mechanism of vancomycin resistance in methicillin resistant Staphylococcus aureus[J].Polish J Microbiol,2004,53(4):207.

[17]顾 兵,童明庆.整合子与细菌耐药[J].临床检验杂志,2005,23(3):226.

[18]糜租煌.细菌耐药的分子机制[J].临床儿科杂志,2005,23(7):422.

[19]蔡培泉,王春新,糜租煌.铜绿假单胞杆菌氨基糖苷类耐药性及其修饰酶基因的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(4):374.

[20]Li X Z.Efflux-mediated multiple antibiotic resistance inPseudomonas aeruginosa[J].中国抗生素杂志,2000,28(10):577.

[21]Keith P.Multidrug resistance in Gramnegative bacteria[J].Curr Opin Microbiol,2004,(4):500.

[22]孙长贵.细菌对抗菌药物耐药性研究进展[J].临床检验杂志,2002,20(特刊):70.

[23]王明贵.喹诺酮类抗菌药的耐药性及质粒介导耐药机制[J].中华医学杂志,2006,86(9):645.

[24]孙义英,胡爱宜,郭生萍.细菌的抗药性变异[J].现代中医药,2002,(3):51.

[25]孙晓刚,宋代军,王金勇,等.饲用抗生素引起的细菌耐药性及其对策[J].中国饲料,2005,(20):30.

[26]谢 轶,杨维青,贾文祥,等.铜绿假单胞菌耐药性在生物被膜形成过程中的变化[J].中华微生物学和免疫学杂志,2005,25(4):314.