白色念珠菌毒力因子的蛋白质组学研究进展

王斌，曾明，王雪松，袁静

白色念珠菌（Candida albicans）是人体皮肤黏膜的正常寄生菌，也是临床上重要的条件致病性真菌。它可引起皮肤、黏膜及内脏的念珠菌病，是免疫力低下宿主感染的重要致病真菌之一，可导致浅表或深部的白色念珠菌病。近年来，器官移植免疫抑制剂、广谱抗生素的使用、癌症放疗化疗的增多、各种生物装置的体内置入和导管的留置、广谱抗菌药物的滥用和艾滋病的流行等，使得免疫功能低下者不断增多，深部真菌感染作为一种并发病，感染率大幅上升，已成为这些疾病患者死亡的主要原因。同时由于白色念珠菌为真核生物，其生物化学代谢途径与人类宿主有很高的相似性，很多抗真菌药物都会有副作用或者只能抑制而不能真正杀死病原生物。因此，念珠菌病已经从轻微的感染成为现代生物医学中重要的临床问题。由于几种常用抗真菌药物（如两性霉素 B、唑类药物和一些新的细胞壁抑制药）的效能降低、副作用较重、抗真菌类耐药性的出现，以及缺乏准确和快速诊断方案[1-3]，使这种致命性条件致病菌的发病率在持续增长。因此，白色念珠菌的毒力问题一直广受关注。

白色念珠菌既为正常菌又是条件致病菌，它能够逃逸机体的免疫系统、治疗药物等，在合适的条件下进入机体组织内引起疾病。因而白色念珠菌的致病性和毒力可能是由一组因子决定，而不是由单一的物质决定的。白色念珠菌的几种毒力表现为对环境变化的适应性（即表型转换和二态性）、对宿主细胞及组织的黏附性及分泌水解酶等[4-6]。对其毒力因子的研究已成为蛋白质组学的主要研究内容，试图揭示白色念珠菌由正常菌变为致病菌的机制，从而控制白色念珠菌感染、发现新的疫苗或能够有更好治疗作用的抗真菌药物的靶标。

1 白色念珠菌的白-灰转换

1.1 转换系统

白色念珠菌的白-灰转换是自发的，而且很常见，由光滑、白色、椭圆的菌落（白色期）转变为扁平、灰色、细长或豌豆型的菌落（灰色期），除了菌落形态上的转化，还有其他表型的转换，如抗原的表达，对人类上皮细胞的黏附，对嗜中性粒细胞氧化剂的敏感性，活性蛋白酶的分泌，酵母-菌丝转换中的环境约束及对药物的敏感性等[4]。因此，这种表型转换极有可能使白色念珠菌具有既能是正常菌又可能是致病菌的独特的适应性，使白色念珠菌能很快适应环境或身体内的特殊部位条件的改变，侵入组织内，逃避免疫监控和（或）发展为药物耐受。

1.2 转换的蛋白质组学研究

表达谱蛋白质组学等方法已经用于白色念珠菌白色期与灰色期细胞蛋白质全谱的比较，以期检测到某一期内的有调控功能又能够阐明其中机制的单一蛋白[7-8]。Prasad 等[7]用同位素标记白色期和灰色期的胞质蛋白进行的蛋白质组学研究发现白色期有 1 个特异的蛋白点，而灰色期有2 个。他们进一步对从白色期和灰色期分离的 mRNA 的体外翻译表达产物进行了双向电泳（2-DE）比较分析，同样证明了灰色期特异的 mRNA 翻译表达出的蛋白质，共有3 个蛋白点的差异[8]。由于白-灰形态转换时的转换在细胞表面及抗原表达中都存在，可以推测对细胞壁的蛋白质组学研究，以及对这两期细胞的其他假想的相关蛋白的蛋白质学研究一定会鉴定出新的转换相关蛋白。

2 酵母-菌丝转换

2.1 白色念珠菌的多形性

白色念珠菌是一种多形性的生物体，形态学上可以包括：①酵母样出芽细胞；②假菌丝；③菌丝或菌丝体；④厚壁孢子。酵母样出芽细胞到菌丝转换最初的形成阶段是芽管的形成。在特殊的宿主环境的刺激下，酵母与菌丝生长之间的转换能力，决定着白色念珠菌的侵袭力。这 2 种形态在临床损害中都存在，可能在致病过程中都发挥作用，而菌丝能够更牢固的黏附宿主细胞，可以促进组织渗透[9]。由于菌丝的向触性和向药性，菌丝能够发现上皮和内皮的破损表面并进行渗透，侵入宿主组织。在体外模拟实验中发现这种二态性可以由许多环境条件来调节，如温度、pH及营养状态（血清、N-乙酰氨基葡萄糖、脯氨酸等）[10]。

近年来，已经建立了大量白色念珠菌酵母和菌丝蛋白的2-DE 参考图谱[11-15]，可以进一步直接分析酵母-菌丝转换过程中表达物的改变。现已鉴定到很多与代谢、能量产生、转录因子及热休克反应相关的蛋白。

2.2 二态性转换的进化

自从1980年起对白色念珠菌进行蛋白质组分析以来，几组研究人员[11,16]已经利用表达蛋白质组学为基础的手段揭示了酵母-菌丝转换相关的蛋白，并且注意到形态发生的机制及对毒力的间接影响，通过 2-DE 对白色念珠菌酵母细胞和菌丝的全蛋白质组学或特异的亚蛋白质组学进行定性和定量的比较，分别获得蛋白表达的差异以及蛋白表达水平的数据，然后通过质谱鉴定出二态性转换相关的蛋白[17]。

大多数全细胞蛋白样品的 2-DE 图谱分析没有发现白色念珠菌的菌丝体细胞存在重新合成的蛋白质[18]。虽然在温度调控的二态性的图谱中，以及通过进一步的免疫吸收和丝状体缺失菌株试验中，发现了 33 个酵母特异性胞质蛋白点和 10 个菌丝特异性胞质蛋白点，但只是发现这些“菌丝体特异”蛋白实际上是在酵母中蛋白质的修饰体，在酵母和菌丝体免疫蛋白质组学研究中也得到相似的结果。Brown和 Chaffin[19]按白色念珠菌形态发生的不同时间段进行了详细的亚蛋白质组学分析，检测到 5 个酵母特异性蛋白点及 2 个下调的菌丝蛋白点，解释了菌丝体特异蛋白的缺乏是由于形态发生时基因表达的改变，而不是由于已存在于出芽细胞蛋白的修饰形式。

从总体看，在未经纯化的全细胞蛋白的 2-DE 图谱上很难看出白色念珠菌不同形态发生阶段的差别。有人构建了菌丝体缺陷型，用 pH 调节二态性进行蛋白质组学分析，只分辨出 1 个酵母特异性蛋白和 1 个菌丝特异性蛋白。导致这种不显著变化的原因可能是翻译后修饰、转化率或是由于 2-DE 技术不能检测低丰度调控蛋白的缺点造成的。同样，依赖 pH 的葡萄糖和半乳糖诱导的芽管和不依赖 pH的N-乙酰氨基葡萄糖诱导的芽管的 2-DE 图谱中蛋白表达的差异也比较少。由于白色念珠菌生长或 pH 特异性的蛋白的表达不受形态发生因素的影响，因而也没有发现与形态有关的独立的蛋白。这些蛋白质组学发现表明，大量涉及二态性的蛋白在细胞内似乎是一种低水平表达或是短暂出现。因此，研究者开始剖析一些关键的亚蛋白质组学，而不是全蛋白质组学，去研究关于两种形态建立的线索[11,16]。

Choi 等[18]在对血清和温度调控的二态性的菌丝胞质蛋白的蛋白胶图中可见的 11个上调蛋白点中的 6 个蛋白点用 MALDI-TOF-MS 鉴定出了 3 种蛋白质，其中 Pra1p（pH 调节抗原）和 Phr1p（pH 应答蛋白）首先被圈定为涉及形态发生的分子。这 2 种蛋白在菌丝细胞中糖基化程度很高，而缺失突变株的比较蛋白质组学研究表明，Pra1p的表达依赖 Phr1p 的存在，说明 PRA1 基因可能位于PHR1 基因的下游。但是，这种调节机制对菌丝转换的作用效果还需要进一步的研究。目前已知几种转录因子和介导其信号转导的蛋白能够调控酵母和菌丝特异性基因的表达[20]，Niimi 等[21]利用肝素的阴离子特性，带有 DNA 结合活性的蛋白可以通过肝素-琼脂糖亲和层析被分离出来，证明了一些 DNA 结合蛋白包括 DNA 结合复合物中的蛋白，在二态性转换期间的合成是不同的。这表明在 S100 层析柱中检测不到的低丰度蛋白可能是细胞对白色念珠菌早期芽管形成有关的生理应答、相关的细胞周期和形态发生中的变化起关键作用的调控因子。

白色念珠菌酵母-菌丝转换包括了细胞壁的组织和成分的变化。大部分细胞壁蛋白中的蛋白可以根据它们与其他细胞壁结构成分的相互作用而分离出来。这种细胞壁蛋白经过富集后蛋白质组学分析，揭示了发生在酵母-菌丝转换期间的细胞壁变化与细胞壁蛋白组成的数量及性质变化都是密切相关的[11]，在出芽和丝状体中的调控是不同的，2 种形态的细胞壁蛋白与胞壁多糖（β-葡聚糖和壳多糖）的共价结合也不同。这些显著的现象阐明细胞壁蛋白-壳多糖的连接很可能是大多数细胞壁蛋白共价吸附菌丝细胞壁的保持机制。用 MS 及 MS-MS 联用方法在酵母和菌丝细胞中鉴定出了 15 种不同调控的细胞壁蛋白，发现了菌丝体壁上有些糖酵解的酶有很强的表达，而且不论是新的结构装入细胞壁还是局部的细胞壁组成成分间的共价结合都在芽管形成时发生。

Urban 等[22]通过不渗透膜的生物素结合的亲和纯化的蛋白质组学方法，也获得了白色念珠菌细胞壁蛋白与酵母和菌丝细胞的非共价连接的表达差异。尽管在 2 种生长形式的中发现了 26 个不同的细胞壁蛋白，而在 2 种形态中都发现了 4 种细胞壁蛋白，但只有 1 种蛋白——硫醇特异性抗氧化剂样蛋白（Tsa1p）——证实了在二态性转换期间的表达差异，发现 Tsa1p 定位在酵母形式的细胞核和细胞液内，在菌丝中这种蛋白定位有部分转移到细胞的表面，说明它在细胞壁的表达可能被不同的移位作用所调控。

3 黏附作用

3.1 过量的宿主识别生物分子

黏附是致病过程的关键步骤，也是定植的必需条件，是重要的入侵前奏。许多真菌细胞的表面成分或基团，如特异性受体、疏水性蛋白质或寡聚蛋白，可以介导白色念珠菌与上皮或内皮细胞、细胞外基质蛋白（如层黏连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白）、血清蛋白（如纤维蛋白原、维蛋白溶酶原、iC3b 和 C3d 补体片段）、植入宿主体内的医疗器具（形成所谓的生物膜）等结合，这些识别宿主的生物分子被称为黏附素。它们可变性提示了白色念珠菌侵袭和定植位点的多样性[23-24]。

3.2 新型宿主识别生物分子

科学家的最初研究集中在“结构蛋白质组学”，应用这种技术可以同时筛选白色念珠菌的细胞表面蛋白，这些蛋白可以与宿主配体通过蛋白-蛋白相互作用进行识别和介导附着，即黏附素配体相互作用。随着 2-DE 和应用特异抗体的蛋白质印迹技术的发展，蛋白质组技术为白色念珠菌中发现与黏附相关的新蛋白或基团特性的分析作出巨大贡献[25-27]。

3.2.1 纤维蛋白溶酶原结合蛋白 与其他微生物病原体一样，白色念珠菌可能黏附宿主的纤维蛋白溶酶原并且诱导其激活，随后触发宿主衍生的蛋白酶水解系统，能够潜地增加真菌对组织的侵袭和分解作用，如白色念珠菌穿过体外血-脑脊液屏障的能力会由于纤维蛋白溶酶原的活性形式——纤维蛋白溶酶的存在而增强[28]。

Crowe 等[25]应用 2-DE 和随后的配体与纤维蛋白溶酶原印迹技术、MALDI-TOF MS分析时，在白色念珠菌细胞壁蛋白抽提物中鉴定出 8 种蛋白质（4 个糖酵解和 1 个发酵相关的酶，2 个氧化还原蛋白，1 个延伸因子），具有与纤维蛋白溶酶原结合能力，其中大部分是具有 5 个羧基末端含有赖氨酸残基的细胞壁蛋白。同时这些结果也得到了生物化学试验的支持，证明了纤维蛋白溶酶原与细胞壁蛋白的结合依赖于这些残基，而不是甘露糖蛋白的糖基基团，因为这类结合：①受赖氨酸类似物 εACA 的抑制；②用碱性羧基酶处理后结合力降低；③在蛋白糖基化缺陷的白色念珠菌突变体中保守。其他的功能分析表明，结合到白色念珠菌细胞表面的纤维蛋白溶酶原可能被宿主纤维蛋白溶酶原激活子激活为纤维蛋白溶酶。虽然纤维蛋白溶酶与白色念珠菌结合后能够在体外降解纤维蛋白，但并没有增加在穿透和损伤内皮细胞、侵入内皮基质方面的能力，因此，还需要进一步研究纤维蛋白溶酶原的激活在白色念珠菌体内侵袭过程中的作用。

3.2.2 泛素化的细胞表面受体 在白色念珠菌中表达的特异表面受体中，整合素样受体能够应用 RGD 序列通过蛋白-蛋白相互作用结合宿主蛋白，这类整合素样受体包括层黏连蛋白、纤维蛋白素原、纤连蛋白、iC3b 和 C3d 补体片段等[29]。2-DE、多克隆抗体抑制泛素和 3个纯化的整合素样受体蛋白的抗体做的免疫印迹实验都表明了白色念珠菌的表面受体是泛素化的。泛素化修饰在调节这些受体活性中发挥了主要作用，并且因此而影响到白色念珠菌对宿主结构的黏附作用。

3.2.3 疏水性蛋白质 细胞表面疏水性似乎在黏附宿主细胞、细胞外基质蛋白和导管以及躲避吞噬细胞的监视方面发挥了重要作用。Singleton 等[30]应用疏水相互作用色谱、高效液相色谱、2-DE、免疫印迹、LC-MS/MS等方法，鉴定出了 Csh1p 蛋白（38 kD 的细胞表面疏水蛋白），此蛋白是新的、功能未知的白色念珠菌基因产物，能够介导与宿主蛋白配体的结合[31]。

4 胞外水解酶的产生

4.1 广泛的底物特异性

白色念珠菌能够产生与毒力相关并且具有广泛底物特异性的胞外水解酶，如分泌型天冬氨酸蛋白酶（Sap）、磷脂酶和脂肪酶等。在芽体和丝状体形式的菌体中都发现了这些酶，它们分别提高了宿主表面点状腔的糜烂和在酵母菌丝中的渗透性生长。这些水解酶可能有助于细菌渗透和侵袭宿主屏障、黏附到宿主黏膜表面、使宿主防御分子失活，并可以通过水解作用将聚合物分解为营养源[32]。白色念珠菌的胞外蛋白水解活性归因于 Sap 的存在，Sap 是由 SAP 基因家族的 10 个基因编码的，这些 Sap（特别是 Sap酶谱中的主要同功酶 Sap2p）能够水解多种宿主底物，包括结构蛋白、蛋白酶抑制物、级联系统中的蛋白、体液防御蛋白、细胞表面蛋白、细胞外基质等[32-33]。

4.2 白色念珠菌胞外蛋白的水解活性

通过在白色念珠菌细胞培养基中添加黏蛋白作为氮源或碳源，富集培养滤液进行蛋白质组学分析，可以鉴别作为主要黏蛋白降解酶的 Sap2p，也可以检测少量的可能是黏蛋白分解产物的蛋白质。黏蛋白分解时可以观察到它的 N 末端氨基酸序列与成熟的 Sap 无同源性，而且其酶谱和代谢标记均为阴性。白色念珠菌 Sap2p 的胞外黏蛋白分解活性可以用酶谱方法进行测定。此外，以前报道过小鼠空肠灌胃接种白色念珠菌，这种体外研究更加提示了 Sap2p 能够作为酶负责体内黏蛋白层的进行性的胞外消化。

5 结语

白色念珠菌的毒力因子和致病机制非常复杂，但是目前已完成白色念珠菌的基因组测序和注释。近年来，已经完善了对白色念珠菌生物学和病原特性的解释，一些重要的结果是通过运用高通量的蛋白质组学方法获得的，揭示了白色念珠菌是如何在分子水平上发挥作用的，而这些作用仅靠基因组学的研究是无法预料的。因此，从分子水平研究有机体的功能生物学也随着技术的提高得到了快速发展。随着对白色念珠菌的黏附素、磷脂酶等毒力因子以及其与细菌、巨噬细胞等相互作用研究的深入，白色念珠菌在黏附有机物表面或活组织后是如何将信号传导到细胞核导致基因进行协调表达的等过程将会逐步被揭开。对这种相互作用网络的了解，必将对白色念珠菌感染的预防和治疗提供有益的线索。

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