RNA干扰在肿瘤治疗研究中的应用进展

孙廓 张键 陈统一

(复旦大学附属中山医院骨科,上海 200032)

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种生物进化过程中出现的高度保守现象。1998年Fire证实Guo等[1]发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量内源或外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)所致并将这一现象命名为RNAi[2]。2000年Zamore等[3]确定RNAi发生在转录后水平。RNAi现象的发现为肿瘤的基因治疗研究提供了一种新的方法,通过RNAi抑制基因的表达已成为肿瘤研究及治疗的新策略。

1 RNAi的作用机制及特点

RNAi引发基因沉默都要经过两个保守的生物学过程:①起始阶段不同来源的dsRNA被 Dicer(dsRNA-specific endonuclease)切割产生 siRNA(small interfering RNA)片断;②效应阶段Dicer与核酸内、外切酶及siRNA等一起形成核糖核苷酸蛋白复合物(RNA inducingsilencingcomplex,RISC),在ATP供能的条件下RISC中的核酸内切酶切断特异序列mRNA,mRNA残基随后迅速地被降解,从而沉默目的基因产生RNAi现象。RNAi具有高效特异性、遗传性、长度限制性与浓度、时间及ATP依赖性等几个特点。

2 RNAi与肿瘤:治疗性研究

现有的肿瘤治疗方法有手术切除、放射治疗和药物化学治疗,这些治疗方法均不能特异性地杀伤及完全根除肿瘤,而且有较大的副作用。RNAi可使突变基因稳定静默,而不影响正常基因的表达,且具有简易性、特异性及高效性的特点,在肿瘤的研究及治疗上有着无可比拟的优势,并取得一系列的成果。

2.1 RNAi与癌基因及抑癌基因 许多肿瘤的发生是由于染色体上某个基因突变,RNAi可以针对变异基因设计干扰片段,从而特异性抑制变异的mRNA表达。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在大多数胃癌中过表达,并与胃癌的发病相关,RNAi抑制人胃癌细胞中的OPN的表达,能有效抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭[4]。研究表明肾癌细胞中检测到OPN的表达,利用siRNA下调OPN的表达后伴有线粒体相关凋亡通路的激活以及MMP-2和uPA等侵袭相关蛋白的表达下调,显著增加肿瘤细胞的凋亡同时减少其侵袭能力[5]。

Ras家族基因点突变与细胞癌变有关。Zhao等[6]发现敲除肝癌细胞中N-ras的表达能诱导细胞停滞在G0/G1期,显著抑制人肝癌细胞的生长。Shi等也在胰腺癌细胞株中应用 RNAi双重沉默Ras/MAPK和PI3K/Akt信号转导通路的关键蛋白K-ras和Akt2后,能有效的诱导肿瘤细胞凋亡,有望为肿瘤治疗提供新的策略[7]。

2.2 RNAi与细胞凋亡抑制基因 在肿瘤的发病机制中凋亡受抑是肿瘤细胞恶性克隆增殖的基础。凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)是一类结构上相似的蛋白质,目前已发现了8种IAP:X染色体相关IAP(XIAP),细胞IAP(c-IAP1,c-IAP2)、神经元 IAP、Survivin、Apollon、Livin、和IAP样蛋白-2。IAPs主要通过抑制特定的胱门蛋白酶来抑制细胞凋亡,在多种人肿瘤中可以检测到 IAPs病理性的过表达。研究[8]发现 c-IAP1,c-IAP2在骨肉瘤中表达升高,并且利用RNAi敲除c-IAP1,c-IAP2后可抑制骨肉瘤的生长。研究[9]报道利用RNAi在人结肠癌中封闭XIAP的基因表达,可增强其对化疗的敏感性,促进细胞凋亡并延缓肿瘤的生长。Ku等[10]转染SurvivinsiRNA至膀胱癌T24细胞,肿瘤细胞停滞于G2/M期,明显促进肿瘤细胞凋亡。另有研究[11]报道利用RNAi沉默Survivin的表达后,可以抑制肿瘤细胞增殖,减少动物模型中肿瘤成瘤率,延长动物生存期。

Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2抗凋亡蛋白家族的主要成员,作用是调控细胞生存和凋亡,在许多人肿瘤中呈现过表达。研究[12]报道靶向Bcl-2和Bcl-xl的siRNA能增强各种因素诱导的肿瘤的细胞凋亡,并能增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。利用RNAi沉默凋亡抑制基因有望成为肿瘤基因治疗的一种很有前景的治疗模式。

2.3 RNAi与细胞信号转导通路相关基因 肿瘤的信号转导通路是一个非常复杂的网络系统,在肿瘤的发生过程中,某些基因的改变可以导致信号传导通路的改变。细胞周期蛋白(cyclin)D1作为细胞周期调节因子之一,其过表达是多种人原发性肿瘤的特征,对肿瘤的诊断和预后判定具有重要意义。Deharvengt等[13]在胰腺癌中利用靶向cyclin D1的shRNA降低cyclin D1蛋白水平,能减少肿瘤细胞体外生长和侵袭及体内肿瘤血管形成。cyclin E是一类核蛋白,调控细胞从G0或G1期进入S期。Todd等[14]发现在70%的RB+/p16+卵巢肿瘤中cyclin E表达异常增高,利用siRNA抑制cyclin E的表达后,肿瘤细胞大量蓄积于G1期,从而认为cyclin E是卵巢癌又一潜在的治疗靶点。cyclin B1作为调节细胞有丝分裂的正性调节因子,在细胞增殖中起到重要作用。Crombez等[15]在鼠荷瘤模型中利用瘤内注射cyclin B1-siRNA后,可以有效抑制肿瘤生长。

2.4 RNAi与肿瘤侵袭转移相关基因 肿瘤的侵袭转移是一个主动过程,肿瘤细胞通过运动穿破宿主结缔组织、血管、淋巴管壁,从而进入体液循环,再次穿破结缔组织、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成转移灶。Liu等[16]在前列腺癌中利用shRNA抑制OPN的表达后,发现MMP-2和MMP-9的表达同时下调,导致前列腺癌细胞在体外的增殖、迁移及侵袭均受到抑制,同时抑制动物体内肿瘤生长。

尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)是肿瘤侵袭和转移过程中降解细胞外基质的重要成分之一,在肿瘤转移中发挥重要作用。Salvi等[17]通过选取高表达uPA的肝癌细胞系,转染 uPA-siRNA抑制uPA基因表达,结果显示转染细胞的迁移能力、浸润性和增殖力均下降,这有望成为新型的肝癌基因治疗手段。Gondi等[18]同时阻断uPA和uPA受体的表达,结果显示细胞色素C从线粒体中释放并伴有caspase-8的激活,提示凋亡的发生。这些研究为多样化利用RNAi研究肿瘤和治疗肿瘤提供了实验依据。

Bmi-1(B-cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1)与许多人肿瘤的发生、增殖及侵袭性相关,并被认为是诊断肿瘤的一项重要指标。研究[19]报道应用RNAi抑制Bmi-1的表达可以显著影响肿瘤细胞生长、侵袭,诱导肿瘤细胞凋亡。

2.5 RNAi与肿瘤血管生成相关基因 实体肿瘤的生长和增殖依赖于肿瘤血管的生成,这一过程取决于血管生成因子和抑制因子的相互拮抗和平衡。血管内皮生长因子(vascular endothelial grow th factor,VEGF)被认为是最主要的血管生成因子,其高水平表达是多种肿瘤转移和预后的独立指标。VEGF能特异地促血管内皮细胞分裂、增殖,可以促进血管的生长和侧支循环的建立。Kim等[20]根据VEGF的基因序列设计了特异性的siRNA,转染人前列腺癌细胞后肿瘤组织的血管密度和肿瘤体积显著下降。另有研究[21]表明抑制VEGF的表达后可以抑制新生血管形成,促进肿瘤细胞凋亡,减小肿瘤体积。

缺氧诱导因子1-α是主要存在于实体肿瘤组织中的缺氧反应性因子,在维持细胞能量代谢、肿瘤血管形成和转移等方面起着重要作用。研究报道在宫颈癌、上皮卵巢癌、胰腺癌及肝癌等中利用RNAi抑制缺氧诱导因子-1α的表达后,可以有效地下调MMP-2,减少VEGF产物生成和血管形成,抑制肿瘤生长,具有肿瘤综合治疗的潜能。

2.6 RNAi与肿瘤耐受放化疗相关基因 恶性肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞产生多药耐药(MDR)。目前越来越多的研究认识到耐药的机制包括转运蛋白的表达、药物排出增加及药物诱导的凋亡逃避等[22]。转运蛋白 ATP-结合盒(ATP-binding cassette,ABC)和P-gp是由MDR1基因编码的膜蛋白超家族,具有广泛的细胞功能,可调控药物局部渗透,并激活宿主免疫系统等[23]。在不同的肿瘤模型体内外转染siRNA下调MDR1基因表达,从而抑制P-gp蛋白或ABC转运蛋白的表达,可增加抗肿瘤药物在细胞内的蓄积,增加化疗敏感性。MDR1-siRNAs有望成为治疗MDR1依赖性多药耐药肿瘤的治疗新方法。Sun等[24]报道用靶向癌基因Ras-shRNA与长春新碱联合治疗人肝癌细胞,结果表明下调Ras的表达可以消除长春新碱诱导的P-gp和MDR1过表达,更有效的抑制人肝细胞肝癌的生长。Mu等[25]对Bcl-XL的实验发现经靶向siRNA处理的前列腺癌耐药细胞对顺铂更敏感。

放射治疗导致细胞损伤的主要靶点是DNA,其中经DNA双链断裂损伤最为重要。针对DNA双链断裂时信号修复蛋白ATM和PKC等亚单位设计siRNA是增强肿瘤放疗敏感性的良好靶标。Li等[26]应用靶向ATM蛋白的siRNA可以减少该蛋白的表达,从而显著加强对放疗的敏感性。XIAP的过表达与人类肿瘤耐受放疗有关,Wang等[27]设计靶向 XIAP的质粒 shRNA,稳定转染至人喉癌Hep-2细胞株,下调XIAP基因表达后肿瘤细胞明显停滞于G0/G1期,并导致喉癌细胞的放疗敏感性明显增强。所以靶向敏感基因的siRNA联合放化疗无疑给肿瘤耐受传统治疗的患者带来了新的希望。

3 展 望

RNAi作为一种新兴的沉默特异基因序列的方法,以其快速、可靠、操作简单的特点吸引了广大科学研究者的关注,为各种肿瘤的基因疗法提供了新策略。然而,RNAi的临床应用还存在着诸多问题,如设计高度特异性的siRNA,非编码区的RNA是否对RNAi敏感,如何将siRNA安全导入细胞并在细胞内稳定地表达,siRNA药物的靶向传递系统及实际应用的安全性等,这些问题有待于科研工作者进一步努力去解决。

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