黄芪甲苷对体外炎症状态下单核细胞NF-κB及糖皮质激素受体表达的影响

冀晓俊 李昂 段美丽 张淑文

(首都医科大学附属友谊医院重症医学科,北京 100050)

核因子κB(NF-κB)是一种广泛存在的核转录因子,在炎症刺激时促进多种细胞因子的基因转录,在细胞因子介导的炎性反应中起重要作用,在炎性反应复杂的细胞因子网络中,NF-κB的活化可能是一个中心环节[1-2]。糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)是核受体超家族成员,它作为一种配体活化转录因子发挥作用。GC广泛存在于人和哺乳动物的各种有核细胞中,其作用是介导糖皮质激素在细胞内发挥生物效应。激活的GR通过直接与NF-κB的制了NF-κB的活性而抑制了多种细胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 和 TNF),一些和炎症相关的酶(COX-2,iNOS)及某些黏附分子(ICAM-1,E-selectin,V-CAM)的转录[3],从而起到抑制炎性反应的作用。

严重脓毒症的抗炎治疗目前仍是一个有待解决的难题,开发新的抗炎治疗药物对控制全身炎性反应,降低脓毒症病死率具有重要意义。越来越多的临床实践及基础研究证实,一些传统中药具有明确的抗炎作用。黄芪被认为具有良好的抗炎作用[4]。已证实黄芪的多种分离物均有不同程度抗炎作用,其中以黄芪甲苷作用尤为显著。本研究观察黄芪甲苷对炎症状态下单核细胞中NF-κB及糖皮质激素受体表达水平的影响,进而推测黄芪甲苷可能的药理机制。

1 资料与方法

黄芪甲苷由中国科学院兰州化物所进行提纯分离,纯度为97.6%;实验中首先用DMSO将药物完全溶解,然后再溶解于DMEM培养基(DMSO浓度不超过1%),之后使用0.22μm 滤器过滤除菌,保存于4℃。

Wistar大鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所,许可证编号:SCXKII-07-0012);RPMI-1640培养基(Gibco公司);胎牛血清(北京元亨圣马公司);脂多糖(北京碧云天生物技术研究所;编号:E coli,0111:B4);GR、TNF-α、NF-kB 抗体、全蛋白提取试剂盒、Western Blotting ECL试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;尼龙膜(Schleicher&Schuell公司);PVDF膜(Immobilon TM-P,Millipore公司);CO2孵箱(SANYO MCO-17AI);PCR仪(PTC-200型);超净工作台(SG-400);高速低温离心机(Sorvall ST-21)。Western blot电泳仪(美国Bio-Rad);Western转膜仪(BioRad);凝胶成像系统(Gel-Doc1000,美国Bio-Rad)。

1.1 实验分组

在25 cm2细胞培养瓶中分组培养单核细胞,分为:①正常单核细胞对照组(NC);②黄芪甲苷对照组(AS);③脂多糖对照组(LPS);④糖皮质激素实验组(LPS+Dex);⑤黄芪甲苷实验组Ⅰ(LPS+As);⑥黄芪甲苷实验组Ⅱ(LPS+As+Dex)。实验中,脂多糖浓度为:100μg◦L-1(此浓度下作用72 h,细胞死亡率接近95%),黄芪甲苷浓度为:100 mg◦L-1(黄芪甲苷95%有效量,ED95)。

1.2 反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测黄芪甲苷对糖皮质激素受体和细胞因子表达量的影响

在25 cm2细胞培养瓶中分组培养单个核细胞;培养48 h以后,收获细胞;用1×PBS洗涤细胞3次;用T RIZOL提取细胞总RNA;以分光光度计定量细胞总RNA后;扩增目标细胞因子特异片段,最后Image ProPlus软件进行灰度分析。引物设计见表1。

1.3 Western blot方法检测黄芪甲苷对糖皮质激素

配胶完成后,将样品细胞去培养液后用PBS冲洗2～3遍;加入适量冰预冷的裂解液对细胞进行裂解并定量;将不同分组细胞的蛋白样品调整至等浓度后,依次上样电泳、转膜、封闭及杂交,最后使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法进行显色。

表1 RT-PCR实验中引物序列

2 结 果

2.1 脂多糖刺激单个核细胞后,黄芪甲苷对脂多糖刺激细胞后相关基因mRNA表达的情况(图1)

结果发现:①LPS刺激后糖皮质激素受体-α mRNA表达量有所下降,加激素组与单纯LPS刺激组比较无明显差异,黄芪甲苷可使糖皮质激素受体-αmRNA表达量表达显著增加;②LPS刺激后糖皮质激素受体-β mRNA表达显著增加,加激素或黄芪甲苷后与单纯LPS刺激比较均无明显差异;③LPS刺激后NF-kB mRNA表达显著增加,加激素或黄芪甲苷后与单纯LPS刺激比较均无明显差异;④LPS刺激后TNF-αmRNA表达增加,地塞米松能抑制其表达,单用黄芪甲苷对其表达也具有抑制作用,联合激素和黄芪甲苷对其抑制作用更明显。

2.2 脂多糖刺激单个核细胞后,黄芪甲苷对脂多糖刺激细胞后相关蛋白表达的情况

分组后,提取细胞蛋白,通过Western blot方法检测下述蛋白(GR 、TNF-α、NF-κB)的表达 ,以 Actin作为内参(图2)。成像后通过Image ProPlus软件进行灰度分析,并统计数据,制成柱形图。

图2显示,蛋白含量检测结果与mRNA检测结果基本一致。此外,还可以明显看出:正常细胞GRβ蛋白表达极低,其表达水平明显低于GRα,LPS刺激后GRβ的表达明显上升,相比之下,GRα无明显变化。

3 讨 论

黄芪主要含有黄芪苷(astragaloside)I、II、IV 等皂苷类、黄酮类、氨基酸类、多糖类、生物碱等[5]。为明确其中主要抗炎成分,我们经初筛实验,发现黄芪甲苷能明显保护体外炎症状态下的单核细胞。为进一步探索黄芪甲苷的保护机制,本实验主要研究了黄芪甲苷对NF-κB和糖皮质激素受体及细胞因子TNF-α表达水平的影响。

GR是作为糖皮质激素(glococorticoid,GC)配体发挥作用的主要受体。与激素结合后,活化的GR进入细胞核,以同源二聚体的形式与特异的DNA序列糖皮质激素反应元件(glucocorticoid responsive element,GRE)结合,调节靶基因转录表达。GR-GC复合体主要通过阻断NF-κB活化而抑制炎性反应[6]。NF-κB是一种广泛存在的核转录因子,被认为是炎性反应的主要驱动因子,涉及到100多种基因的转录,包括 IL-1、IL-6、TNF-α等。在无外界刺激时,NF-κB杂二聚体与抑制蛋白IκB结合,并与PKA的催化亚基(PKAC)结合,呈非活性状态,位于胞质中。当暴露于脂多糖、细胞因子(IL-1、TNF-α)、紫外线辐射、氧自由基等许多外界刺激下,NF-κB活化。活化的NF-κB与GR通过蛋白间相互作用,阻断DNA结合及随后的转录活性而起到相互抑制作用[7]。

本实验结果提示:LPS刺激后GR-α水平有所下降,黄芪甲苷可使GR-α表达显著增加;LPS刺激后NF-kB及TNF-α表达显著增加,激素及黄芪甲苷均对 NF-kB表达无明显影响,但激素能抑制TNF-α表达,单用黄芪甲苷对其表达也具有抑制作用,联合激素和黄芪甲苷对其抑制作用更明显。这一结果通过Western blot和RT-PCR方法在蛋白水平和mRNA水平都得到验证。由此可见,黄芪甲苷能显著增加GRα的表达,与激素联合能显著抑制细胞因子TNF-α的产生,在细胞水平具有明显抗炎作用;本研究表明黄芪甲苷增加炎症状态下细胞的GR表达可能是其发挥抗炎作用的关键机制。

GR有不同的亚型,不同型的GR可介导不同的生物学过程。GRα和GRβ生物学活性存在差异,GRα在静息状态下主要定位于胞浆,其活性依赖于配体的存在,在胞浆与糖皮质激素结合后进入细胞核,以同源二聚体的形式与特异的DNA序列糖皮质激素反应元件(glucocorticoid responsive element,GRE)结合,调节靶基因转录表达。同时,GRα还以二聚体或单体的形式和其他核转录因子结合,通过直接的蛋白-蛋白相互作用调节它们的功能。与GRα相比,GRβ不能与糖皮质激素作用,静息状态下主要分布在胞核内,GRβ能与GRα以异二聚体形式结合GRE,从而抑制GRα的活性,对GRα起着负调节作用[8]。由于GRβ蛋白的半衰期是GRα蛋白的2倍,因此,一些促炎症细胞因子刺激将诱导GRβ不成比例地(相对于GRα)堆积。

本研究并未显示LPS作用单核细胞后出现GRα数量明显下降。但本研究显示正常细胞GRβ蛋白表达极低,几乎测不到,其mRNA水平明显低于GRα,而在 LPS刺激后GRβ的表达明显上升,相比之下,GRα的表达无明显变化。由此可见,LPS刺激下GRβ表达水平上调可能是严重感染时出现外周糖皮质激素抵抗的机制之一。

1 Baeuerle PA,Baltimore D.NF-κB:ten years after[J].Cell,1996,87:13-20.

2 Maniatis T.Catalysis by a multiprotein IkappaB kinase complex[J].Science,1997,278:818-819.

3 Christman JW,Lancaster LH,Blackwell TS.Nuclear factor κB:a pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy[J].Intensive Care Med,1998,24:1131-1138.

4 Zhang WJ,Hufnaql P,Binder BR,et al.Antiinflammatory activity of astragaloside IV is mediated by inhibition of NF-κB activation and adhesion molecule expression[J].T hromb Haemost,2003,90(5):904-914.

5 Hu JY,Han J,Chu ZG,et al.Astragaloside IV attenuates hypoxia-induced cardiomyocyte damage in rats by upregulating superoxide dismutase-1 levels[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(4):351-357.

6 Zhang ZC,Li SJ,Yang YZ,et al.Effect of astragaloside on cardiomyocyte apoptosis in murine coxsackievirus B3 my ocarditis[J].J Asian Nat Prod Res,2007,9(2):145-151.

7 Mckay LI,Cidlowski JA.Molecular control of immune/inflammatory responses:Interactions between nuclear facto r-kappa B and steroid receptor-signaling pathways[J].Endocr Rev,1999,20:435-459.

8 Bamberger CM,Bamberger AM,de Castro M.Chrousos GP:Glucocorticoid receptor beta,a potential endogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans[J].J Clin Invest,1995,95:2435-2441.