光学成像在肿瘤骨转移实验研究中的应用进展

王江涛，王捷

综述

光学成像在肿瘤骨转移实验研究中的应用进展

王江涛，王捷

骨肿瘤；肿瘤转移；体层摄影术，光学

目前对肿瘤骨转移的影像学评估主要依靠SPECT、PET、X线和微CT等显像技术，这些影像模式在空间分辨率、敏感性及信号定量方面都有自己的优势。然而，在肿瘤骨转移过程中，不仅有骨组织结构的改变，还有血管再生、肿瘤间质的相互作用、宿主免疫反应等病理生理变化。近十几年来，随着光学成像探针及成像模式的不断发展，光学成像技术已成为肿瘤临床前实验研究必不可少的一种分子影像评估手段，它能够对肿瘤的生长、转移、基因表达、血管再生、细菌感染、局部酶活性等进行实时检测及定量分析[1-3]，从而为肿瘤骨转移提供功能性信息，现综述如下。

1 全身光学成像——技术和设备

所有的光学成像都是基于对活细胞组织或者动物发出的光子进行检测。活体动物体内光学成像主要采用生物发光（bioluminescence imaging，BLI)和荧光发光（fluorescence imaging，FLI）两种技术。二者在灵敏度、信噪比、组织来源的背景等方面各不相同。检测时选用BLI还是FLI主要取决于细胞标记物；此外，BLI成像技术可以检测细胞的新陈代谢，而FLI成像技术则可观察体内外所有的组织细胞。

1.1 BLI成像技术

BLI成像具有背景低、信噪比高、无创、检测时间短、可同时检测多个动物的优点，因此非常适合生命科学领域的实验研究。

BLI成像中最常使用的荧光素酶是从萤火虫中提取的。萤火虫发光细胞中含有荧光素和荧光素酶两种发光物质，它们与ATP、氧发生反应，在氧与荧光素结合时发生电子转移，引起能量变化，释放荧光光子而发光。由于需要活性氧的参与，因此只有在活细胞内才会出现荧光，光的强度与标记细胞的数目呈线性相关；发射光谱较宽，峰值在560 nm附近。其他可用的荧光素酶是从珊瑚、水母、红色或绿色的叩头虫以及一些细菌物种中克隆出来的。这些绿色或红色的荧光素酶被氧化后发射出绿光（544 nm）或红光（611 nm）[4]。有学者最近在对萤火虫和叩头虫提取的荧光素进行研究的基础上制备出耐热的荧光素酶，并证实其可分辨体内和体外的绿色和红色荧光信号[5-6]。来自珊瑚虫、海洋叩头虫的荧光素酶同腔肠素反应（不依赖ATP）可发出蓝光，发射光最大峰值480 nm。尽管这些酶发射光波长较短，分布局限，腔肠素在小动物体内流动较快，但已有研究证实其在体内分子诊断方面非常有效[7]。

使用荧光素酶作为体内成像的工具，特别是对动物组织的深部进行成像时，组织穿透性、光散射及组织自发荧光都是影响成像的重要因素。波长越长则自发荧光就越低；同绿光相比，近红外光几乎不引起自发荧光；而且光渗透性、组织吸收及散光等现象都会减弱[8]。需要强调的是，由于细胞株不同，不管是表达萤火虫荧光素酶还是Gaussia荧光素酶，它们都不会与所对应的底物荧光素和腔肠素发生交叉反应，因此可以利用这一属性对所有荷瘤动物进行全血微量生化分析[9]。

1.2 FLI成像技术

FLI成像费用低廉、操作简单，荧光信号远强于BLI，而信噪比却远低于BLI。

与BLI不同，FLI不需要底物的参与，但需要外部激发光源，且自身荧光的强度随着目标深度的增加呈指数级的递减。FLI有多种发光方式，既可将荧光报告基团（GFP、RFP，Cyt及dyes等）或其突变体基因整合到细胞染色体上以表达荧光蛋白，在激发光源的作用下发光；也可利用一些荧光基团标记特定的物质，注入小动物体内而发光[10]。

活体FLI成像技术有3种标记方法：（1）荧光蛋白标记：适用于标记肿瘤细胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等。目前已研发出发射光谱可达649 nm的荧光蛋白，具有背景低、组织穿透力高的特性，如从突变的蔬菜和奶嘴海葵中提取的红移蛋白[11]；而最新从哺乳动物体内提取的荧光蛋白——基于细菌的光敏色素，其激发光波长可达700 nm[12]。（2）荧光染料标记：与体外标记方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以标记抗体、多肽、小分子药物等。（3）量子点标记：作为一种新的标记方法，量子点标记具有荧光发光光谱窄、量子产率高、不易漂移、激发光谱宽、颜色可调、光化学稳定性高以及不易分解等诸多优点。量子点是一种能发射荧光的半导体纳米微晶体，尺寸在100 nm以下，外观恰似一极小的点状物，可经受反复多次激发，而不像有机荧光染料那样易发生荧光淬灭。其发射光强度是有机荧光染料的20倍，稳定性较有机荧光染料强100倍以上。已有研究证实，量子点成像的深度远远超过标准的荧光素，如果能与抗体结合配对，则可作为跟踪组织细胞的探针或用以探测低浓度的抗体。而如能解决不同材料的量子点偶联、功能化标记问题，就可以用量子点代替很多荧光染料分子[13-14]。

1.3 成像设备

小动物全身光学成像系统近几年得到快速发展，但大多数BLI系统只能进行半定量检测，空间分辨率也不高。最近研发的BLI断层成像系统通过提高空间分辨率来实现三维成像，同时还能提供定量信息[15]，此外，3D BLI和3D FLI数据的采集及后续重建还可获得解剖学、功能信息及分子信息。Nahrendorf等[16]将PET、微CT和3D生物发光组合，可同时检测骨骼结构以及肿瘤的整合蛋白、组蛋白酶活性和巨噬细胞含量。而通过光谱分离技术建立的新型荧光发光系统则可捕获每个图像的光谱信息，去除背景荧光后还能区分多种荧光标记，反映同一张图片不同的光谱信息[17]。

2 肿瘤骨转移的光学成像检查

在肿瘤骨转移的过程中，肿瘤和周围微环境的互相作用介导原发灶血管生成及自身免疫系统激活，从而获得免疫抑制以利于肿瘤的生长；此外，骨转移灶通常是破骨细胞和成骨细胞失衡之处，使肿瘤细胞易于在此生长。而光学成像系统的特点使其可以对骨骼、肿瘤、肿瘤和间质的反应、血管生成及生成前信号通路等的变化进行光学成像以实现对肿瘤骨转移的评估和检测[18-19]。以往肿瘤光学成像技术发展中遇到的问题是肿瘤细胞通常没有特异的光学物质使之与正常组织区分开来，但近年来照相检测系统的发展使全身光学成像技术同样可以用于细胞株或转基因动物模型的研究；同时，随着荧光分子断层成像（fluorescence molecular tomography，FMT）、3D FLI及3D BLI信息采集技术的发展，不仅可以针对肿瘤骨转移病人收集3D光学数据，还可结合其他影像学工具（如微CT，PET，SPECT，MRI）进行后处理，从而使光学成像成为一种新型的肿瘤骨转移成像平台。

2.1 骨组织光学成像用特异性探针

目前有很多商品化的骨组织检测特异探针，如VisEn公司研发的OsteoSense和LI-COR公司研发的BoneTag，其中OsteoSense-680的激发光波长为680 nm，发射光为700 nm；OsteoSense-750的激发光波长为 750 nm，发射光为 780 nm；BoneTag-680的激发光波长为680 nm，发射光为705 nm；BoneTag-800的激发光波长为774 nm，发射光为789 nm。探针可与骨基质结合数天或数周，没有结合的探针将被洗脱，从而显示激活区域特异的发射荧光信号动态。需要注意的是，由于探针的半衰期较长，结合到骨基质上将限制重复测量的结果。Kozloff等[20]注射不同浓度的OsteoSense-750以验证其在体内吸收的线性关系，结果显示，当注射剂量达到100 nmol/kg时，股骨远端的平均荧光强度呈线性关系。

用于体内肿瘤细胞标记和检测的靶向荧光探针主要有EGF-800CW和2DG-800CW，这两种探针都可用于转移到骨或其他组织的肿瘤的影像学检测。EGF-800CW包含重组表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），可连接到近红外的荧光燃料IRDye®800CW上；2DG-800CW与2-脱氧葡萄糖结合，为细胞的葡萄糖转运蛋白-1所识别。靶向荧光探针识别后既不参与细胞代谢也不穿过细胞膜，只是在细胞膜上与表达EGF受体的细胞选择性结合，而EGF受体在很多不同类型的肿瘤细胞上呈过表达。此类探针的应用无需表达报告基因[21-22]。

2.2 骨肿瘤光学检测的动物模型

骨组织是很多肿瘤（特别是乳腺癌和前列腺癌）的常见转移部位。X线检查可间接观察骨转移的溶骨和成骨现象，但无法进行微小转移灶的检测，因此需要更加灵敏的方法。Wetterwald等[23]对裸鼠心脏注射转染荧光素酶基因的乳腺癌细胞MDA-MB-231，制备乳腺癌转移模型，光学成像系统检测发现，注射细胞3 min后癌细胞扩散至全身各个部位；15 min后癌细胞在特定的组织器官如肺、脑、长骨等部位大量聚集；24 h后未检测到任何细胞，表明大部分注射的细胞已死亡；20 d后可在裸鼠长骨的骨髓中观察到0.5 mm3的微小转移灶，较X线影像检查提前2周发现骨转移。胫骨内注射肿瘤细胞是制备骨髓腔内肿瘤生长模型的最直接方法，可迅速了解肿瘤细胞在骨组织内侵袭生长的情况。在胫骨内注射带有荧光标记的乳腺癌细胞MDA-MB231后1周即可通过BLI技术检测到肿瘤细胞的生长情况，结合使用微CT进行3D重建可以清晰显示胫骨的溶骨性病变，而放射影像检测在2周后才发现转移灶[24]。由此可见，光学成像系统可以较为快速、清楚地观测到稳定表达荧光素的肿瘤细胞在转移部位的生长、侵袭及远处的转移。除移植转染荧光酶基因的肿瘤细胞外，有学者建立带有荧光素酶基因的自发肿瘤的转基因动物模型，而随着自发肿瘤的发展，肿瘤组织所表达的荧光素酶也随之增加[25]。

3 骨转移过程中相关因子的光学检测

基质降解、渗透、血管生成在肿瘤的进展和转移中起着关键作用，阻断其中任一环节都能有效预防肿瘤的发生和转移。而光学成像的最大优势即是对这些环节进行实时可视化检测，因此在肿瘤骨转移的临床前研究中应用光学成像技术对了解肿瘤骨转移作用机制、寻找预防肿瘤骨转移方法等都具有非常重要的意义。

3.1 生物因子检测

转化生长因子（transforming growth factor，TGF）在肿瘤发展和转移中发挥重要作用。在骨转移过程中，TGF-β是激活肿瘤细胞表达溶骨因子的一个信号因子，可导致骨溶解的恶性循环[26]。通过使用表达荧光的细胞株来实时检测TGF-β变化，并将PET、微CT与BLI、FLI技术相结合，可以对干扰TGF-β信号通路的新型治疗方法进行有效评估[27]。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是调节血管生成的重要因子，而肿瘤血管生成是促进肿瘤转移的重要外部因素。为实时检测VEGF2在体内的表达，Zhang等[28]对标记荧光素酶的VEGFR2转基因小鼠的研究结果显示，荧光素与VEGFR2的表达水平呈正相关；Backer等[29]使用含有N末端半胱氨酸标签的单链VEGF（scVEGF），可用于结合不同的特定位点；另有研究证实，基于scVEGF的家族可与肿瘤血管的VEGF受体结合，标记近红外光染料Cy5.5的scVEGF可用于肿瘤脉管系统VEGF的光学成像[30]。

αvβ3整合素家族在新生肿瘤脉管系统的内皮细胞、破骨细胞和一些肿瘤细胞内呈高水平表达，而包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨的酸（RGD）序列的玻璃黏连蛋白可选择性结合到αvβ3和αvβ5的受体上，因此标记荧光的RGD探针可以检测αvβ3的表达水平，将其用于肿瘤、肿瘤脉管系统及破骨细胞的研究则可检测到肿瘤的骨转移[31]。商业化的近红外荧光探针IntegriSense可高度特异性地结合到阳性内皮细胞和肿瘤细胞αvβ3的表面[32]。

3.2 局部酶活性检测

测定局部酶活性是观察基质降解和局部炎症的另一种方法。ProSense是一种酶激活的荧光试剂，是包含多聚赖氨酸骨架、聚乙二醇和一些荧光团的大分子，荧光团上大分子之间的距离可使荧光信号淬灭。荧光团经酶消化后释放，释放的荧光团不被淬灭，可由活体成像系统检测到。ProSence通常被组蛋白酶激活，而激活的破骨细胞表达组蛋白酶K，导致骨基质的降解。组蛋白酶K在溶骨性病变中呈高表达，Kozloff等[33]运用cy5.5标记组织蛋白酶K，实验证实组蛋白酶的高表达加速骨溶解进程。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性与肿瘤细胞的侵袭、迁移转移、炎症以及宿主反应密切相关。通过VisEn的专有荧光成像探针平台开发的MMP Sense（TM）探针即是一种能够反映肿瘤和活体中其他炎症部位MMP活性的活体分子探针[34]。

4 展望

小动物的光学成像在检测肿瘤骨转移的发生发展过程及药物干预疗效方面是非常实用有效的手段之一，可以进行体内实时、无创的可视化检测。其最终目的是将活体光学成像技术的应用范围从临床前实验研究拓展到临床检测研究，从而提高肿瘤骨转移诊断的特异性和敏感性，并进一步为其个体化治疗及预防提供指导。光学成像技术与传统影像学工具如X线、CT、SPECT、MRI以及病理学研究相结合，可以从结构、功能、分子及解剖水平全面评估肿瘤骨转移的发生、发展、治疗效果以及转移灶骨骼、血管、肿瘤大小及分子的功能状况。但目前光学成像还面临一些关键技术问题需要解决，包括研发特异性光学探针、建立特异性转基因动物模型以及开发研制更为灵敏的检测设备等。

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R738，R445.9

A

1674-666X(2010)04-0302-05

2010-11-05；

2010-11-30）

（本文编辑 白朝晖）

10.3969/j.issn.1674-666X.2010.04.012

510010广州军区广州总医院医学实验科

王捷，E-mail：jiew@tom.com