肺结核患者外周血中Th细胞极化偏移及临床意义分析①

胥 萍 施美华 费晓峰 朱传武 吴妹英 吴敏娟 陈永井 张学光

（苏州市第五人民医院中心实验室,苏州 215007）

肺结核患者外周血中Th细胞极化偏移及临床意义分析①

胥 萍 施美华 费晓峰 朱传武 吴妹英 吴敏娟 陈永井②张学光②

（苏州市第五人民医院中心实验室,苏州 215007）

目的:分析初诊肺结核患者外周血中CD4+T淋巴细胞及其亚型Th1和Th2细胞的改变,探讨其在肺结核病变过程中的临床意义。方法:取肝素抗凝全血,加RPMI1640培养液等体积混匀,依次加入1∶1 000稀释的PMA、1∶100稀释的Ionomycin和1∶10稀释的Monensin,混匀后于37℃,5%CO2静置培养4小时或过夜。取100μl培养血细胞依次加入抗人CD3-Per-CP、CD8-APC、m IgG1-FITC、Rat IgG1-PE、IL-4-PE、IFN-γ-FITC抗体,按流式操作流程分别进行细胞膜和细胞浆内标记测定CD4+IL-4+（Th2）、CD4+IFN-γ+（Th1）两种细胞的水平。结果:初诊肺结核患者外周血中Th1水平均显著低于健康对照组（P＜0.01）,而Th2水平则显著高于健康对照组（P＜0.05）。粟粒型肺结核患者外周血中Th1细胞含量显著低于浸润性肺结核患者（P＜0.05）,而Th2水平显著高于浸润性肺结核和结核性胸膜炎（P＜0.05）。CD4+/CD3+T细胞比例在这三个病程中呈下降趋势,且粟粒型肺结核显著低于浸润性肺结核（P＜0.05）。糖尿病并肺结核患者Th1、CD4+/CD3+显著低于无糖尿病肺结核患者（P＜0.05）,Th2含量则显著升高（P＜0.05）。15例重度肺结核患者经结核化疗与微卡治疗三个月后Th1、CD4+/CD3+水平较治疗前明显升高（P＜0.05）,而Th2水平较治疗前显著降低（P＜0.01）。痰检或培养阳性与痰检阴性患者相比Th1、CD4+/CD3+水平呈下降趋势但无显著差异（P＞0.05）,Th2细胞水平显著升高（P＜0.05）。结论:浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核、糖尿病并肺结核患者存在着不同程度的免疫功能抑制,对Th1、Th2细胞水平与CD4+/CD3+比例测定有助于临床病情的判断和疗效观察。

肺结核;细胞免疫;Th细胞;细胞极化

据传染病疫情报告,目前肺结核已居传染病发病数及死亡率第一,其疫情的快速上升已令世界卫生组织高度重视。以往多注重诊断、治疗、耐药等方面的研究,对其免疫功能的变化易忽视,而多数结核病患者都伴有免疫功能的异常,其结核病免疫是CD4+T淋巴细胞介导的细胞免疫应答,对结核病的发生、发展具有重要意义。CD4+T淋巴细胞因分泌不同因子而分为Th1和Th2型,其平衡与疾病的转归与愈合密切相关。为揭示肺结核患者体内Th细胞的极化特性,本研究应用流式细胞仪对患者外周血Th1/Th2进行检测分析,进而探讨其在肺结核免疫发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究病例 肺结核组73例,（其中浸润型肺结核41例、结核性胸膜炎13例、粟粒型肺结核9例、肺结核合并糖尿病10例）。性别为男45例,女28例。年龄14～66岁,平均年龄为37.5岁。年龄、性别与对照组统计学处理无差异。临床诊断以《肺结核诊断和治疗指南》为标准[1]。

结核病确诊依据[1]:①痰、胸水结核分支杆菌呈阳性,或活组织检查呈结核特征性病变;②X线胸片肺及其它部出现结核特征性病灶;③临床结核中毒症状明显、其它检查符合结核性特征;④抗结核治疗后病灶、胸水吸收快。具备上述标准三项以上者方可确诊。

判断结核活动进展期、吸收好转期、稳定期的标准:①活动进展期:凡具备下列一项者属活动进展期:新发现活动性结核病灶;新出现空洞;空洞增大;病灶较前恶化;痰结核分支杆菌阳性。②吸收好转期:凡具备下列一项者属好转期:结核病灶较前吸收好转;空洞闭合变小;痰结核分支杆菌阴转。③稳定期:病变无活动性;空洞闭合;痰结核分支杆菌连续阴性（每个月至少检查1次,达六个月以上,如有空洞存在,则痰结核分支杆菌须连续阴性一年以上。

1.1.2 健康对照组 30例健康对照者均选自献血员及健康体检者。胸部X透视正常,近期无接触结核病史者。男 20例,女 10例。年龄 20～60岁,平均35.7岁。PPD皮试5单位（IU）结果为阴性。

1.2 试剂与设备

1.2.1 主要试剂 鼠抗人CD3-PerCP、CD8-APC、IFN-γ-FITC、IL-4-PE、mIgG1-FITC,Rat IgG1-PE,FACS细胞破膜剂和FACS细胞溶血素（两者使用前均用去离子水1∶10稀释）均购自BD公司。

1.2.2 其他试剂 激活剂:佛波酯（phorbolmyristate acetate,PMA）于DMSO中调至浓度为0.1mg/ml,工作浓度为25 ng/ml。协同刺激剂:离子霉素（ionomycin）于乙醇中配成浓度0.5mg/m l,工作浓度为1 μg/ml。蛋白转运抑制剂:莫能霉素（monensin）溶于乙醇中调节浓度为0.1mg/m l,工作浓度为1μg/m l。不含谷氨酰胺的RPMI1640、二甲基亚砜（DMSO）等均为美国Sigma公司产品。

1.2.3 仪器 FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司;TC2323水套式CO2培养箱为美国SL公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标本的采集 空腹采集静脉血2m l于肝素钠抗凝管中,混匀备用。

1.3.2 细胞培养 取肝素抗凝全血200μl,加RPMI1640培养液200 μl混匀,取 200 μl加1∶1000稀释的 PMA 10μl,1∶100稀释的 Ionomycin 10 μl,1∶10稀释的Monensin 3.4μl,混匀后加入5%CO2培养体系37℃静置4小时或过夜。

1.3.3 淋巴细胞表面抗原及胞浆内细胞因子染色对照管和测定管分别加入培养全血100μl,依次加入抗人CD3-PerCP,CD8-APC荧光单克隆抗体10 μl,混匀后室温避光反应15分钟。加入FACS 1∶10稀释溶血剂2 ml,混匀,室温避光15～20分钟。1 300 r/min离心5分钟后弃上清液。加入含叠氮钠无菌PBS 2ml,洗涤后加 1∶10稀释的FACS破膜剂各 500μl,室温避光10分钟,加PBS 2m l,混匀,1 300 r/min离心5分钟,弃上清。对照组加入m IgG1-FITC或Rat IgG1-PE各10μl,检测组加入抗人IL-4-PE或IFN-γ-FITC各10μl,室温避光反应 30分钟,加入 2 ml PBS洗涤后弃上清。用500μl PBS重悬细胞,利用流式细胞仪检测分析。以CD3+-SSC选定CD3+T细胞,为R1门,以 R1设门,CD3-PerCP、CD8-APC 作图选定CD4+T细胞,为 R2门,对照管m IgG1-FITC、Rat IgG1-PE作图划定阴性区域,再换测定管,检测IFN-γ、IL-4阳性细胞的含量（见图1）。

1.4 统计学处理 数据由SPSS12.0软件包处理,两样本均数（±s）用t检验。P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 肺结核患者外周血中免疫细胞比例异常 流式细胞仪检测结果显示,73例肺结核患者外周血中Th1、CD4+/CD3+细胞所占百分比较健康对照组显著降低（前者P＜0.01,后者P＜0.05）,而Th2细胞水平较健康对照组显著升高（P＜0.05,表1）。

2.2 肺结核患者外周血中Th1极化与疾病的恶性程度呈负相关 流式细胞仪检测结果显示,浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核三组间外周血中Th1细胞比例逐步下降,而Th2则有所上升（表2）。三组间粟粒型肺结核与浸润性肺结核Th1、CD4+/CD3+水平有显著降低（P＜0.05）,与结核性胸膜炎、浸润性肺结核Th2水平比较有显著升高（P＜0.05）。由此可见,随着患者CD4+/CD3+细胞降低,Th1/Th2细胞比值逐渐增高。

2.3 糖尿病并肺结核患者外周血中Th1/Th2细胞含量异常失衡 糖尿病并肺结核患者外周血中CD4+/CD3+的比值相对无糖尿病肺结核患者略小,免疫功能低下,两组间Th1/Th2比值有显著差异（表3）。

图1 人外周血各淋巴细胞亚群的选择及分析Fig.1 The selection and analysis of human peripheral lym phocyte

表1 73例肺结核患者与健康对照组外周血 Th1/Th 2、CD4+/CD3+水平比较Tab.1 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+in the peripheralblood of73 pulmonary tuberculosis patients or healthy donors

表2 浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核 Th1/Th2、CD4+/CD3+比较Tab.2 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+in the peripheral blood of infiltrative pulmonary tuberculosis,tuberculous p leurisy andm iliary pu lmonary tuberculosis patients

表3 DM并肺结核与无糖尿病肺结核患者外周血Th1、Th2、CD4+/CD3+水平Tab.3 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+between the patients with pulmonary tuberculosis disease and the patientswith both pulmonary tuberculosis and diabetes disease

表4 15例重度患者经药物与微卡治疗三个月前后Th1/Th2、CD4+/CD3+的水平Tab.4 The levels of Th1,Th2 and CD4+/CD3+in 15 severe pulmonary tuberculosis patients after receiving tuberculosis chemotherapy and m icrocalorie theropy for threemonths

表5 肺结核痰检或培养阳性、阴性患者的Th1、Th2、CD4+/CD3+水平Tab.5 The levels of Th1,Th2 and CD4+/CD3+in the patients with positive or negative sputum exam ination results

2.4 肺结核患者治疗疗效与Th细胞平衡相关 流式细胞仪检测分析结果经统计学分析表明,15例重度肺结核患者经结核化疗与微卡治疗三个月前后Th1/Th2、CD4+/CD3+的水平有显著改善（表 4）。临床观察发现疗效显著（症状明显改善或消失,肺部病灶吸收良好）的患者外周血中Th1、CD4+/CD3+水平较治疗前明显升高（P＜0.05）,而Th2水平较治疗前显著降低（P＜0.01）。

2.5 Th细胞极化与结核杆菌密切相关 流式细胞仪检测结果显示,痰检或培养阳性与痰检阴性Th1、CD4+/CD3+比较有下降趋势但无显著差异（P＞0.05）,痰检或培养阳性与痰检阴性相比Th2细胞水平则有显著升高（P＜0.05,表5）。

3 讨论

1986年,Mosmann等[2]在小鼠模型上首次发现CD4+T细胞的两个亚群Th1与Th2,1991年Romagnan[3]在人类病变组织浸润的淋巴细胞上也发现了同样的细胞特性。随后,许多学者对Th1与Th2在肺结核病理、生理过程中的作用机制展开了一系列的研究,结果表明,CD4+T细胞对结核分枝杆菌感染的保护性免疫作用主要是分泌多种细胞因子而放大免疫效应。Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ,诱发细胞免疫应答,其中IFN-γ能够通过增强作为效应细胞的巨噬细胞表面人类组织相关抗原Ⅱ（MHCⅡ）分子的表达,促进巨噬细胞对抗原的递呈和自身的活化,启动机体的免疫应答。IFN-γ也可通过诱导巨噬细胞内某些介导呼吸爆发的酶的合成,使杀菌物质合成增加[4],赋予巨噬细胞更强的杀菌能力。同时,IFN-γ进一步促使Th0分化为Th1细胞亚群,增强Th1细胞免疫应答,有助于杀伤病原微生物。Th2细胞主要分泌IL-4和IL-10,有效激活B细胞产生抗体,参与诱导体液免疫应答。IL-4能抑制巨噬细胞的活化,拮抗IFN-γ活化巨噬细胞后的效应[5]。因此,Th2细胞合成的细胞因子能减缓由巨噬细胞介导的免疫应答。有学者认为在刺激状态下IL-4表达增加与结核性空洞形成密切相关[6]。所以,当这种平衡失调时,将直接影响结核病的进展。Th1和Th2分泌的多种细胞因子相互调节、相互抑制,对结核病的治疗和转归起着重要的作用。

本研究中我们选取健康志愿者及不同程度的结核病患者外周血,应用流式细胞术进行一系列的分析,结果表明肺结核患者Th1细胞数量较健康对照组低（P＜0.05）,且随着病情加重呈现下降趋势,患者体内存在Th1、Th2细胞亚群的转化而使Th1、Th2的比例失衡,同时,CD4+/CD3+的比值与Th1呈正相关。我们认为,可能是病变部位CD4+T细胞和巨噬细胞的凋亡增强,而且该比值预示结核病恶化的倾向[7]。体外研究发现细胞凋亡增强是与结核分枝杆菌反应性T淋巴细胞数目的减少或缺失同时发生的,从而导致宿主淋巴细胞对结核分枝杆菌的反应低下。Hirsch等[8]认为结核分枝杆菌反应性T淋巴细胞凋亡的增加可能导致结核杆菌在宿主体内长期存在。有研究认为,结核病患者对结核分枝杆菌是以Th1细胞为主的细胞免疫抑制,Th1细胞的抑制能力与疾病严重程度密切相关[9]。同时,Th2细胞数量增加提示疾病可能向重症发展。我们在痰检阳性和阴性两组病例比较中发现,阳性患者Th2细胞水平显著升高（P＜0.05）,胸片显示有空洞的占35.6%（16例）。由此推测,Th2细胞数量增加可能降低宿主的细胞免疫功能,使疾病向重症、排菌和空洞形成的方向发展。糖尿病并发肺结核患者由于免疫功能低下,使得IFN-γ的分泌量较低,其细胞免疫功能严重受抑,而IL-4水平却显著增加,使病情迁延难愈。15例重度结核病患者经结核化疗与微卡治疗后Th1和Th2细胞数量均显著改善。微卡治疗对人和动物无毒无害,具有与结核分枝杆菌相似的抗原表位和免疫原性,含有丰富的I型抗原和65 kD抗原,可有效介导保护性免疫反应,促进Th1细胞分泌更多的IL-2和IFN-γ等细胞因子,进而激活巨噬细胞,使得巨噬细胞吞噬结核杆菌的能力增强[10]。本研究中肺结核患者临床微卡治疗采用每周一次22.5μg肌注,三个月一疗程。研究结果提示,抗结核治疗和免疫辅助治疗相结合有助于提高患者机体的免疫功能,患者外周血中Th1细胞较治疗前增加（P＜0.05）,而Th2细胞含量较治疗前显著降低（P＜0.01）,CD4+/CD3+比值亦显著升高（P＜0.05）,该组结核病患者临床症状明显改善或消失,肺部病灶吸收良好。因此,辅助微卡治疗可以诱导Th0向Th1极化,从而抑制Th2细胞的极化和细胞因子的分泌,使Th1和Th2维持一个动态平衡。

总之,动态分析Th1、Th2细胞比例与CD4+/CD3+比值有助于观测该疾病的临床诊治和转归。

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2 Mosmann T R,Cherwinski H,Bond M Wetal.Two types ofmurine helper T cell clone.I.Definition according to profilesof lymphokine activitiesand secreted proteins[J].JImmunol,1986;136（7）:2348-2357.

3 RomagnaniS.Human Th1 and Th2 susets doubt nomore[J].Immunol Today,1991;12:256-257.

4 Flesch I E,Kaufmann SH.Mechanisms involved in mycobacterial growth inhibition by gamma interferon-activated bonemarrowmacrophages:role of reactive nitrogen intermediates[J].Infect Immun,1991;59（9）:3213-3218.

5 谢惠安,杨国太,林善梓etal.现代结核病学[M].人民卫生出版社,2000:136-235.

6 Van CrevelR,Karyadi E,Preyers Fetal.Increased production of interleukin 4by CD4+and CD8+T cells from patientswith tuberculosis is related to the presence of pulmonary cavities[J].J Infect Dis,2000;181（3）:1194-1197.

7 Swaminathan S,Nandini K S,Hanna L Eetal.T-lympocyte subpopulations in tuberculosis[J].Indian Pediatr,2000;37:489-495.

8 Hirsch CS,ToossiZ,Johnson JLetal.Augmentation ofapoptosisand interferon-gamma production at sites of active Mycobacterium tuberculosis infection in human tuberculosis[J].JInfect Dis,2001;183（5）:779-788.

9 Torres M,Herrera T,Villareal Hetal.Cytokine profiles for peripheral blood lymphocytes from patients with active pulmonary tuberculosis and healthy household contacts in response to the30-kilodalton antigen ofMycobacterium tuberculosis[J].Infect Immun,1998;66（1）:176-180.

10 罗永艾.微卡治疗结核病的机制疗效及安全性[J].中国防痨杂志,2002;24（10）:28-29.

[收稿2009-02-11 修回2009-12-03]

（编辑 倪 鹏）

Study on T helper cells in the patients of pulmonary tuberculosis and the clinical significance of Th polarization

XUPing,SHIMei-Hua,FEIXiao-Feng,ZHUChuan-Wu,WUMei-Ying,WUMin-Juan,CHENYong-Jing,ZHANG Xue-Guang.DepartmentofMedicalLaboratory,No.5HospitalofSuzhou,Suzhou215007,China

Objective:This studywas to analyze the changes of CD4+T lymphocytes and their subtypes,Th1 and Th2 cells,in the peripheral blood of patientswith pulmonary tuberculosisdisease and to investigate their clinical significance in the pathologic processof pulmonary tuberculosis.Methods:For polarizationmeasurement of T-helper cells,1∶100 diluted Ionomycin and 1∶10 dilutedMonensin were added in sequence into the equivalent volumem ixture of heparin anti-coagulated whole b lood and RPMI-1640 culture liquid.After being wellmixed,the mixture was incubated at5%CO2,37℃ for4 hours orovernight.To 100μlof themixture and in sequence,the antibodiesof CD3-PerCP,CD8-APC,m IgG1-FITC,Rat IgG1-PE,IL-4-PE or IFN-γ-FITCwere added.The stained CD4+IL-4+（Th2）and CD4+IFN-γ+（Th1）were analyzed by flow cytometry.Results:Comparedwith those from healthy controls,the peripheralblood of pulmonary tuberculosis patients contained significantly fewer Th1（P＜0.01）but significantlymore Th2 cells（P＜0.05）.Th1 cells in the peripheral blood of the patientswithmiliary pu lmonary tubercu losiswere obviously fewer（P＜0.05）than in infiltrative pulmonary tuberculosis patients.The amount of Th2 cells in the peripheral blood of the patientswithmiliary pulmonary tuberculosiswas significantlymore（P＜0.05）than in either infiltrative pulmonary tuberculosis or tubercu lous pleurisy patients.The ratio of CD4+/CD3+tended to decrease in all these patients,and itwasmuch lower（P＜0.05）in the patients ofm iliary pulmonary tuberculosis than in infiltrative pulmonary tuberculosis patients.Patients suffering from both pulmonary tuberculosis and diabetes had significantly lower levels of Th1 cells and CD4+/CD3+（P＜0.05）and more Th2 cells,compared with those of pu lmonary tubercu losis patientswithout diabetes.Levels of Th1 and Th2 cells restored significantly（P＜0.05）in 15 severe pulmonary tuberculosis patients after receiving tuberculosis chemotherapy andmicrocalorie theropy for threemonths.Patientswith positive sputum examination tended to have decreased Th1 and CD4+/CD3+（P＞0.05）and significantly increased Th2（P＜0.05）.Conclusion:Immunosuppression existed,in different extents,in patients of infiltrative pulmonary tuberculosis,tuberculous p leurisy,miliary pulmonary tuberculosis aswell as patientswith both pu lmonary tuberculosis and diabetes.Analysisof Th1,Th2 and CD4+/CD3+may be benefit for the judgments of disease conditions and therapeutic effects.

Pulmonary tuberculosis;Cellular immunology;Th;Cell polarization

R392.12 R378.91+1

A

1000-484X（2010）02-0178-05

①本文为苏州市科学技术局资助项目[苏财科字（2005）47号]

②苏州大学医学生物技术研究所,苏州215007

胥 萍（1967年-）,女,硕士,副主任技师,主要从事感染免疫学研究;

及指导教师:张学光（1951年-）,男,教授,博士生导师,主要从事协同刺激分子的研究,E-mail:xueguangzh@yahoo.com.cn。

·分子与细胞免疫学·