腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及c-fos蛋白表达的影响①

付立波 王学斌 刘凤莲 （长春师范学院生命科学学院,长春 130032）

腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及c-fos蛋白表达的影响①

付立波 王学斌②刘凤莲②（长春师范学院生命科学学院,长春 130032）

目的:观察腺苷（Adenosine,Ado）对缰核（Habenulanucleus,Hb）神经元单位放电的影响及外侧缰核内c-fos蛋白表达的变化,探讨腺苷对影响睡眠的缰核神经元活动及相关基因表达的影响及可能机制。方法:脑薄片灌注、腹腔内注射、原位免疫细胞化学等。结果:脑薄片灌注腺苷,导致内侧缰核神经元自发放电活动受到抑制,而外侧缰核神经元自发放电活动明显增加;腹腔注射腺苷0.5小时后,与注射生理盐水组相比较,外侧缰核c-fos蛋白的表达量明显增加。结论:腺苷对大鼠内侧缰核神经元自发放电起抑制作用,对外侧僵核神经元自发放电则有兴奋作用,并可促进外侧缰核c-fos蛋白表达,这为腺苷在外侧缰核内可促进睡眠提供了依据。

腺苷;缰核;c-fos蛋白表达;神经元自发放电;大鼠

缰核（Habenular complexes,Hb）存在于脊椎动物背侧间脑,与松果体共同构成上丘脑,可分为内侧缰核（Medial habenular complex,MHb）和外侧缰核（Lateralhabenular complex,LHb）[1,2]。已有研究表明,缰核与睡眠-觉醒周期相关的上下位结构均有着密切的神经解剖学联系,是边缘前脑到脑干背侧通路上的重要枢纽,其内具有与睡眠-觉醒活动密切相关的谷氨酸、γ-氨基丁酸、乙酰胆碱等的受体存在,因此,缰核可能是参与睡眠-觉醒周期调节的重要核团[3]。

腺苷（Adenosine,Ado）是腺苷一磷酸去磷酸后的产物。作为中枢神经系统的一种神经调质,它可降低CNS神经元的兴奋性,在中枢许多部位具有抑制作用[4,5]。近年来的研究结果表明,Ado在CNS中直接或间接参与睡眠、机体防御、镇静及镇痛等作用。腺苷是重要的睡眠调节因子之一,其机制为通过其受体发挥作用,与A1受体结合产生抑制效应,而与A2受体结合产生兴奋效应[6]。

腺苷对中枢神经元的作用主要由A1和A2两型受体介导,A1受体抑制细胞内cAMP产生,A2受体则对cAMP产生起刺激作用。腺苷对A1受体的亲和力比A2受体高100～1 000倍,因此在多数情况下腺苷对细胞的作用主要表现为激活A1受体后产生的细胞生物效应。外源性Ado对中枢的抑制效应是作用于神经元细胞膜上的A1受体的结果。其主要引起突出后膜K+通道激活,K+通透性增加,细胞膜超级化所致。茶碱（Theophylline,TP）是腺苷的非特异性受体阻断剂,可松弛平滑肌、抑制磷酸二酯酶的活性,增强cAMP的作用,而且还是一种有效的中枢神经兴奋剂[7,8]。众所周知,非选择性腺苷受体拮抗剂咖啡因及茶碱可以促进觉醒[8]。

c-fos原癌基因是一类即刻早期基因（Immediate early genes,IEGs）,属核内蛋白类细胞癌基因,其特点是细胞外各种刺激均能诱导包括神经元及神经胶质细胞在内的c-fos原癌基因快速、短暂地表达,并表达在相应的脑功能区[9]。它参与细胞分裂、生长分化[10]、信息识别与传递、学习和记忆等生理活动,也与行为及多种疾病的发生与发展密切相关,并且同动物的清醒水平也有一定的关系[11]。

心外膜应用腺苷后,大鼠脊髓T3节段背角、旁巨细胞外侧核以及丘脑的腹后外侧核、后核、中央外侧核和束旁核等部位Fos蛋白样免疫阳性反应神经元显著增加[11]。说明腺苷对中枢神经系统内c-fos基因的表达有影响。Basheer等研究表明前脑底部输注腺苷可以使大鼠睡眠增加[12]。这说明腺苷与动物的睡眠-觉醒活动有关。国内外此类的研究不少,但是,关于腹腔内注射腺苷对外侧缰核内c-fos基因表达的影响尚未见报道。因此,本实验以外侧缰核为研究中心,采用离体缰核脑薄片灌流方法及脑薄片电活动胞外记录法,研究Ado对大鼠Hb神经元自发放电活动的影响,并采用特异性抗体原位免疫细胞化学方法检测c-fos蛋白,探索外侧缰核注射腺苷和其非特异性受体阻断剂茶碱的c-fos表达规律。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 实验动物为Wistar成年大鼠20只,体重200～230克,雌雄不限,由吉林大学基础医学部实验动物中心提供,用于c-fos实验。饲养期间光照12小时,黑暗12小时,水食任取。

1.1.2 药品与试剂 腺苷配制成3.0 g/L,8-苯茶碱配制成6.0 g/L,二者均为Sigma公司产品;兔抗人c-fos多克隆抗体由福州迈新生物技术开发有限公司提供;多聚甲醛由上海化学试剂有限公司生产。

1.1.3 实验器材 冷冻切片机（山西医疗仪器器械厂）;NVSLM1振动切片机（World precision instruments）;倒置显微镜（O lympus IX71）。

1.2 实验方法

1.2.1 腺苷对缰核神经元自发放电活动的影响

1.2.1.1 缰核脑薄片的制备 实验动物用乙醚浅麻醉,快速取脑,将整个脑组织立即置入0℃人工脑脊液中,停留片刻后取出,放在冰盒上修块,选取含有缰核的大脑组织,马上浸入被 5%二氧化碳和95%氧气饱和的人工脑脊液中,持续通入混合气体,进行震动冠状切片,约400～450μm,依据为 Paxinos和Watson图谱定位缰核。

1.2.1.2 脑片孵育和灌流方法 将孵育脑片的器皿事先放在恒温水浴箱中,充满人工脑脊液,持续通入5%的二氧化碳和95%的氧气的混合气体,气体流量不低于400m l/m in。放入脑片前,人工脑脊液要用气体饱和至少30分钟以上。切片结束后,将含有Hb的脑片收集到充满用5%的二氧化碳和95%氧气的混合气体饱和好的人工脑脊液的孵育器皿中,孵育温度控制在（33±2）℃,孵育时间2小时（不低于2小时,一般2～3小时为宜）。

1.2.1.3 神经元细胞外自发放电活动的记录 单管玻璃微电极内充灌含2%滂胺天蓝的3mol/L醋酸钠溶液。用微电极推进器将玻璃微电极分别插入内外侧Hb,经微电极放大器引导Hb神经元的自发放电。输入Vc-10示波器观察,同时用Pawertab八道生物信号记录仪,进行信号采集和频率分析。与给药前相比,放大频率变化超过20%为有效。

1.2.2 腺苷对缰核神经元c-fos蛋白表达的影响

1.2.2.1 实验动物分组及脑组织标本采集 每天对Wistar大鼠进行3次抓拿训练,进行一周的训练,以减少大鼠对抓拿反应的影响。随机分3组,每组6只（n=6）,即注入生理盐水（对照）组、注入腺苷组和注入茶碱组,分别进行腹腔注射。各注入1m l,注入时间为0.5小时,时间一到,立即腹腔注射戊巴比妥纳将大鼠麻醉,随即开胸,经左心室灌注生理盐水100ml以快速冲洗全身组织血液,继以灌注含4%多聚甲醛的PBS 500ml进行固定,60分钟后断头取出脑组织,置于含4%多聚甲醛的PBS中后固定2天,取外侧缰核的脑组织块,用石蜡包埋,修块,并用LKBⅢ型超薄切片机切成5～8μm切片。

1.2.2.2 大鼠脑切片的染色及固封 采用特异性抗体的原位免疫细胞化学方法,石蜡切片脱蜡和水化后用PBS（0.01mol/L,pH7.4）冲洗,每张切片加一滴过氧化酶阻断剂（试剂A液）,室温下孵育15分钟。然后在每张切片加50μl过氧化酶阻断溶液（抗体）,室温下孵育10分钟。PBS冲洗,每张切片加50 μl正常非免疫动物血清（试剂B）,室温下孵育30分钟。除去血清,每张切片加50μl的兔抗人c-fos多克隆抗体,4℃过夜。过夜后用PBS冲洗,加50μl生物素标记的第二抗体（试剂C）,室温下孵育10分钟。PBS冲洗,每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化酶溶液（试剂D）,室温下孵育10分钟。PBS冲洗,每张切片加100μl新配制的DAB溶液,观察3～10分钟。自来水冲洗,苏木素复染,PBS冲洗返蓝。最后将切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。

1.2.2.3 显微镜下计数c-fos免疫反应阳性神经元的计数 每只大鼠随机取5张切片,在400倍镜下计数核团内一个视野的Fos免疫反应阳性神经元（fos-like）的数量,取其平均数。在观察切片时,每张切片计数3个高倍镜视野。

2 结果

2.1 离体脑薄片灌流腺苷记录对LHb自发放电的影响 实验用大鼠15只,在LHb共记录到20个神经元的单位放电。其中自发放电增加的神经元有12个（60%）,放电频率由（3.29±1.66）Hz增加到（7.57±3.97）Hz（P＜0.05）（图1）;自发放电减少的神经元6个（30%）,放电频率由（4.05±1.09）Hz下降到（3.69±1.72）Hz（P＜0.05）,2个变化不明显（10%）。即LHb灌注Ado对自发神经元放电活动具有明显兴奋作用（60%神经元自发放电增加）。但腺苷A1非特异性受体拮抗剂茶碱（8-PT）能部分阻断自发神经元放电增加的这种效应。

2.2 离体脑薄片灌流腺苷记录对内侧缰核（MHb）自发放电的影响 实验用大鼠9只,在MHb共记录到14个神经元的单位放电。其中自发放电减少的神经元有9个（64%）,放电频率由（4.91±0.63）Hz下降到（2.49±0.48）Hz（P＜0.05）;自发放电增加的神经元4个（29%）,放电频率由（5.84±0.93）Hz下降到（3.02±0.61）Hz（P＜0.05）;2个变化不明显（14%）。即MHb灌注Ado对自发神经元放电活动具有明显抑制作用（64%神经元自发放电活动受到抑制）。但腺苷A1非特异性受体拮抗剂茶碱（8-PT）能部分阻断自发神经元放电减少的这种效应。

图1 离体脑薄片灌流腺苷及8-PT对LHb神经元自发放电的影响Fig.1 Effect of brain slice perfusing Adoand 8-PT in vitro on the LHb neuronal spontaneous firing

图2 腹腔内注射腺苷、茶碱和生理盐水0.5小时后外侧缰核神经元c-fos蛋白的表达Fig.2 The c-fos exp ression in posterolatera l habenu lar nucleus after 0.5 h later in jected i.p.Ado,theophylline and saline

2.3 腹腔内注射腺苷对外侧缰核神经元c-fos蛋白表达的影响 大鼠腹腔内分别注射腺苷,茶碱和生理盐水0.5小时后外侧缰核神经元c-fos蛋白的表达见图2。

由图2可知,腹腔内注射腺苷后,外侧缰核神经元c-fos蛋白的表达为3.7%±2.1%,对照组（注射生理盐水）为0.7%±0.6%,二者相比具有显著的统计学差异（P＜0.01）,即LHb c-fos蛋白的表达明显高于对照组。

腹腔内注射茶碱后,外侧缰核内神经元c-fos蛋白的表达为1.2%±0.7%;与对照组（腹腔注射生理盐水）比较,无显著的统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

缰核是多种生理功能的汇聚点,其神经元的电活动具有明显的昼夜节律性[12],而机体内最具有明显昼夜节律特征的是睡眠-觉醒功能。为进一步证实腺苷在Hb内对睡眠活动影响的生理机制,本实验采用离体脑片灌流腺苷及阻断剂,在内外侧Hb分别记录神经元放电的方法,结果显示,腺苷对LHb神经元有兴奋作用。Hb内含有经典神经递质GABA。GABA是一种抑制性氨基酸,一直被认为与睡眠有关。GABA的合成酶——谷氨酸脱羧酶的正反应产物遍布整个Hb,但MHb明显少于LHb,而且LHb的腹外侧最为密集[13]。本实验的结果显示,腺苷导致LHb神经元兴奋,促进睡眠。推测其机制,有可能是激活了起源于脚内核LHb中的GABA能神经元,进而使GABA释放增多,腺苷可能会抑制缰核内GABA抑制性神经元活动（当然这尚需要进一步的实验证实）,造成缰核的兴奋,是腺苷在外侧缰核引起睡眠的原因。实验结果显示,腺苷可增加LHb神经元的放电,对LHb神经元有兴奋作用,这与在缰核微量注射腺苷中得到的腺苷促进睡眠的作用,可能是腺苷兴奋外侧缰核的结果相吻合,同时也说明腺苷在中枢的促进睡眠作用可通过兴奋缰核来实现。这也从另一角度说明,腺苷作用于不同脑区对睡眠产生的作用可能不同,因为不同部位对睡眠的影响和所分布的受体不同。

另外,在MHb内灌流腺苷自发放电减少的神经元9个（64%）,放电频率由（4.91±0.63）Hz下降到（2.49±0.48）Hz（P＜0.05）。结果表明离体脑片灌流腺苷,MHb神经元自发放电明显受到抑制,结果提示外源性的腺苷对MHb具有抑制效应。侧脑室注射或离体脑片灌流腺苷A1特异性受体拮抗剂（DPCPX）和非特异性受体拮抗剂茶碱（8-PT）,均能阻断腺苷的抑制作用。可能是作用于神经元细胞膜上A1R的结果,引起膜钾离子通道激活,从而使膜超极化所致。这些结果与国内外用其他手段和方法研究的结果基本一致[14,15]。

缰核神经元活动具有明显的昼夜节律性,即在白天表现高频自发放电而在夜间自发放电减少,因此可以认为,缰核可能是哺乳动物昼夜节律组构中的重要部分。本实验结果得知脑薄片灌注腺苷可兴奋LHb神经元,这与电刺激LHb可以引起DRN细胞放电减少相一致[16]。另外,LHb可以通过直接（NMDA介导）和间接（GABA介导）途径影响DRN5-HT的释放[17]。章功良等研究发现抑制或损毁DRN5-羟色胺能神经元则有促进睡眠的作用[18-20],这与本实验得出的结果腺苷在LHb内具有兴奋其神经元自发放电活动的作用相一致。

体内的褪黑素具有促进睡眠、改善睡眠状况等作用,在正常光照下皮下注射给予小鼠褪黑素,使视交叉上核内c-fos蛋白及c-fosmRNA的表达水平均提高[21];前列腺素D2（PGD2）是内源性促睡眠物质之一,具有睡眠调节作用,微透析研究发现PGD2能升高睡眠促进区（基底前脑吻腹侧表面）细胞外腺苷的水平[22],而腺苷及其A2AR可介导PGD2的睡眠诱导作用[23]。陈爽等[24]在灌流颈动脉窦区腺苷时,在孤束核、延髓腹外侧区等观察c-fos蛋白表达,cfos蛋白样免疫阳性反应表达增高。这些研究表明睡眠因子对睡眠区的神经元有活化作用,增加了cfos蛋白的表达。本实验结果显示大鼠腹腔内注入腺苷后,外侧缰核内c-fos蛋白表达为3.7%±2.1%,而对照组（注生理盐水）为0.5%±0.5%,二者相比差异显著（P＜0.01）;即腹腔内注腺苷后,外侧缰核内c-fos蛋白表达高于对照组。本实验结果与以上研究相一致,即大鼠腹腔内注射腺苷可以使外侧缰核内c-fos蛋白的表达增加,为腺苷在外侧缰核促进睡眠提供依据。研究表明桥脑网状结构（Pontinereticular formation,PRF）内注射腺苷A1受体激动剂能够抑制觉醒的发生,增加快动眼睡眠[25],而给予腺苷A1受体拮抗剂能减少睡眠[26]。在剥夺猫的睡眠后,其脑内腺苷含量会越来越高,一旦猫进入睡眠状态腺苷浓度会很快下降,下降到一定程度后猫就会从睡眠中醒来,说明腺苷能抑制神经系统兴奋性,促进睡眠,即腺苷及其类似物可以产生镇静作用及诱发睡眠。本实验结果提示腹腔注射腺苷外侧缰核c-fos蛋白表达增加,为腺苷在外侧缰核内促进睡眠提供了依据。

由于实验结果大鼠腹腔注射茶碱后,外侧缰核内神经元c-fos蛋白的表达为1.2%±0.7%,对照组为0.7%±0.6%,二者相比无显著的统计学差异（P＞0.05）,故我们目前不能对茶碱与大鼠睡眠-觉醒机制的关系得出结论,有关这方面有待进一步研究。

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[收稿2009-08-21 修回2009-11-13]

（编辑 张晓舟）

The effects of adenosine on the discharging electricities and the c-fos expression of neurons in habenula nucleus of rats

FULi-Bo,WANGXue-Bin,LIUFeng-Lian.SchoolofLifeScience,ChangchunNormalCollege,Changchun130032,China

Objective:To investigate the effectofadenosine（Ado）on theunitdischarging electricities in habenulanucleus and on the c-fos expression in lateralhabenular com plex,and the influenceof adenosine on the neuron activities and related geneexp ression involved in affecting sleep in habenulanucleus and the possib lemechanisms.Methods:Intraperitoneal injection,brain flakes pouringof rats,immunohistochemistry and othermethodswere useel.Results:Ado pouring into flakes ofbrain depressed the unitdischarging electricities of neurons inmedial habenular complex（MHb）,butobviously increased thatof lateral habenular comp lex（LHb）.0.5 h after the six rats being injected intraperitoneallywith Ado,the c-fos protein expression in lateralhabenularnucleuswas significantly increased compared to the group with saline injection.Conclusion:Adomay restrain theunit discharging electricitiesof neurons inmedialhabenular complex butexcite those in lateralhabenular complex.At themeantime,Adomay increase the c-fos expression in LHb.This provides the experimental evidence that Adomay improve the sleep quality.

Adenosine;Habenu la nucleus;c-fos expression;Discharging electricities of neurons;Rats

R338.63

A

1000-484X（2010）02-0141-05

①本文为吉林省教育厅“十一五”科学技术研究项目（吉教科合字2008第171号）、长春市科技局资助课题[长科技合（2008255）号-08YJ38]

②临沂师范学院生命科学学院,临沂276005

付立波（1965年-）,男,博士,副教授,主要从事比较生理学与神经生理学方面的研究,E-mail:fulibo000000@126.com。