核苷类似物早期病毒学应答慢性乙型肝炎患者血清sTRAIL水平变化及意义

魏 屏 王 华 曾令兰 朱 励 （华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科,武汉 430022）

核苷类似物早期病毒学应答慢性乙型肝炎患者血清sTRAIL水平变化及意义

魏 屏 王 华①曾令兰①朱 励②（华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科,武汉 430022）

目的:探索核苷类似物早期病毒学应答慢性乙型肝炎患者（CHB）血清sTRAIL水平变化及意义。方法:60例CHB均接受核苷类似物抗病毒药物治疗（拉米夫定或替比夫定）,根据治疗24周末HBV DNA水平将患者分为完全病毒学应答组、部分病毒学应答组、无病毒学应答组,设正常对照组。采集治疗前、治疗4、12、24周末患者的血清,检测血清sTRAIL水平,同时检测IFN-γ、ALT水平。结果:患者治疗前sTRAIL、IFN-γ及ALT水平均较正常对照组升高（P＜0.05或P＜0.01）。sTRAIL水平在完全应答组治疗4周末、部分应答组治疗12周末下降。与治疗前比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,在治疗4周末完全应答组sTRAIL水平低于同期部分应答组（P＜0.05）。IFN-γ水平在完全应答组治疗4周末、部分应答组治疗12周末升高,与治疗前比差异均有统计学意义（P＜0.05）,但完全应答组IFN-γ水平在治疗4周末与同期部分应答组差异无统计学意义。ALT水平在三组的治疗过程中均逐步下降,各时间点间差异均有统计学意义（p＜0.05）。完全应答组治疗前sTRAIL水平与IFN-γ水平、ALT水平呈正相关（P＜0.01）,治疗后sTRAIL水平与IFN-γ水平呈负相关（P＜0.05）。结论:CHB血清sTRAIL水平升高;核苷类似物抗病毒治疗早期病毒学应答者血清sTRAIL水平下降,尤其是完全应答者在疗程的第4周就有明显的变化。sTRAIL在CHB免疫损伤中起重要作用,在其核苷类似物抗病毒治疗免疫恢复中也起重要作用,可作为核苷类似物治疗CHB早期应答指标预测远期疗效。

TRAIL;慢性乙型肝炎;核苷类似物;早期应答

目前应用于临床的所有不同类型的核苷（酸）类似物均难以达到彻底清除病毒特别是清除共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）复制模版的作用,因此,乙型肝炎抗病毒治疗是一长期过程。早期预测核苷（酸）类似物抗病毒治疗的效果,及时调整治疗方案,也是核苷（酸）类似物抗病毒治疗成败的关键。在2007年美国肝病研究学会（AASLD）年会上,Keeffe教授提出了CHB治疗路线图:根据24周时HBV DNA水平来预测远期疗效和调整治疗方案[1],但还有哪些指标可作为早期应答指标预测远期疗效,却少有报道。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是新近被证实的一个新型凋亡分子,广泛表达于多种组织和细胞,对正常生理状态下的机体组织没有毒性,而在病理状态下被激活参与机体的免疫反应,TRAIL被认为是机体的一个典型的免疫监视分子[2,3]。本研究对核苷类似物抗病毒治疗早期出现病毒学应答的慢性乙型肝炎患者（CHB）血清sTRA IL水平进行了动态检测,同时还检测了γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）,丙氨酸氨基转换酶（Alanine amino transferase,ALT）,并进行相关分析,以探讨核苷类似物早期病毒学应答CHB血清sTRAIL水平变化及意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 病人来自2006～2008年本院接受核苷类似物抗病毒治疗CHB,患者服用拉米夫定或替比夫定（拉米夫定100mg/d,替比夫定600mg/d）,据治疗24周末HBV DNA水平将患者分为完全病毒学应答组、部分病毒学应答组、无病毒学应答组,各组随机抽选20名患者,共60例。其中男55例,女5例,年龄18～70岁。诊断符合2000年病毒性肝炎防治方案[4]。均为初治患者,治疗前血清 HBV DNA＞105,ALT≥2×ULN。并同时排除HCV、HAV、HEV及其它原因所致的肝损伤。健康献血员10例作为正常对照。

1.2 检测方法

1.2.1 血清采集与保存 采集治疗前、治疗4、12、24周末患者的血清,肝功能、HBV DNA及时检测,另血清-80℃冻存,统一检测sTRAIL和IFN-γ。

1.2.2 检测方法及试剂和仪器 sTRAIL检测的ELISA试剂盒系美国Invitrogen公司产。sTRAIL的测定将标准品按 3 000、1 500、750、375、187.5、93.7、46.8 pg/m l配制。除空白孔（第一孔）外,将标准品100μl加入相应孔内,样本用样本稀释液1∶2稀释后每孔100μl,依次加入反应孔中,酶标板加上封板胶,36℃放置90分钟后洗涤5次。除空白孔外,将配制好的生物素化抗体每孔加入100μl,酶标板加上封板胶,36℃放置60分钟后洗涤5次。除空白孔外,将配制好的酶结合物（避光室温放置）每孔加入100μl,酶标板加上封板胶,36℃避光放置30分钟后洗涤5次。每孔加入100μl显色液36℃放置15分钟,每孔加入100μl终止液。在酶标仪上读取A450值,并绘制标准曲线,根据标准曲线得出待测血清中sTRAIL的表达量。IFN-γ检测的ELISA试剂盒购自深圳晶美生物有限公司。HBV DNA定量检测采用PCR检测法,Roche lightcycler分析仪,深圳匹基公司试剂。ALT检测采用全自动生化分析仪检测。各试剂盒均严格按照说明书进行。

1.3 疗效评定标准 以治疗24周末HBV DNA的水平将患者分为完全病毒学应答（HBV DNA＜500 copies/ml）、部分病毒学应答（HBV DNA 500～104copies/ml）和无应答（HBV DNA＞104copies/ml）等3组。

2 结果

各组sTRAIL、IFN-γ、ALT水平在治疗过程中的变化见表1、2、3。患者治疗前 sTRAIL、IFN-γ及ALT水平均较正常对照组升高（P＜0.05或P＜0.01）,差异均有统计学意义。疗程中各组sTRAIL水平的变化:完全应答组治疗4周末、部分应答组治疗12周末下降,与治疗前比明显降低（P＜0.05）,差异均有统计学意义;无应答组则无明显变化;在治疗4周末完全应答组sTRAIL水平低于同期部分应答组（P＜0.05）。疗程中各组IFN-γ水平的变化:完全应答组治疗4周末、部分应答组治疗12周末升高,与治疗前相比明显升高（P＜0.05）,差异均有统计学意义;在治疗4周末完全应答组IFN-γ水平与同期部分应答组差异无统计学意义（P＞0.05）;无应答组虽然在疗程中逐渐升高,但各时间点间无明显差异。疗程中各组ALT水平均逐步下降,各时间点间差异均有统计学意义（P＜0.05）,完全应答组在12周末达正常范围,部分应答组在24周末达正常范围,无应答组24周末仍高于正常范围。相关性分析显示,完全应答组治疗前sTRAIL水平与IFN-γ水平、ALT水平呈正相关（r=0.598、r=0.586,P均＜0.01）,治疗后sTRAIL水平与IFN-γ水平呈负相关（r=-0.457,P＜0.05）。

表1 各组sTRAIL在治疗过程中的变化（pg/ml,±s）Tab.1 The sTRAIL level of each group at each stage（pg/m l,±s）

表1 各组sTRAIL在治疗过程中的变化（pg/ml,±s）Tab.1 The sTRAIL level of each group at each stage（pg/m l,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.01;vsbefore therapy at same group,2）P＜0.05;vs partial at same time,3）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 217.2±87.85 — — —Complete 20 1 312.50±390.681） 847.96±433.472）3） 856.05±310.292） 977.83±264.632）Partial 20 1 353.14±558.561） 1 383.60±644.47 910.32±375.422） 994.03±312.432）No 20 1 343.01±583.041） 1 250.75±456.06 1 399.08±664.13 1 255.16±457.17

表2 各组IFN-γ在治疗过程中的变化（ng/L,±s）Tab.2 The IFN-γlevelof each group at each stage（ng/L,±s）

表2 各组IFN-γ在治疗过程中的变化（ng/L,±s）Tab.2 The IFN-γlevelof each group at each stage（ng/L,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.05;vsbefore therapy at same group,2）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 4.44±1.28 — — —Complete 20 6.93±2.801） 8.66±2.372） 9.20±1.602） 9.20±1.872）Partial 20 6.44±2.621） 7.35±2.70 8.7±2.632） 8.92±2.572）No 20 6.17±2.121） 6.62±2.59 6.80±1.97 7.39±2.34

表3 各组ALT在治疗过程中的变化（U/L,±s）Tab.3 The ALT levelof each group ateach stage（U/L,±s）

表3 各组ALT在治疗过程中的变化（U/L,±s）Tab.3 The ALT levelof each group ateach stage（U/L,±s）

Note:vs normal,1）P＜0.01;vsbefore therapy,2）P＜0.05;vs4 weeksafter therapy,3）P＜0.05;vs 12 weeksafter therapy,4）P＜0.05.

Groups n Before therapy 4 weeks after therapy 12weeks after therapy 24 weeksafter therapy Normal 10 28.20±8.47 — — —Complete 20 182.75±98.421） 97.95±69.302） 41.05±19.723） 35.20±22.624）Partial 20 176.00±79.161） 108.75±62.072） 55.50±28.133） 33.25±16.224）No 20 163.10±90.401） 104.40±63.952） 70.70±58.763） 63.95±43.344）

3 讨论

考核慢性乙型肝炎的治疗效果,目前HBV DNA是公认的最佳指标,HBV DNA下降情况直接反映了患者对抗病毒药物的应答情况。但仅仅HBV DNA下降不是慢性乙肝的治疗目标。EASL2009慢乙肝指南提出了不同的治疗终点:使HBV DNA持续阴性是最基本的治疗目标,HBeAg血清转换乃至HBsAg消失或甚至产生HBsAb血清转换才是理想的治疗终点。而只有通过机体免疫恢复或增强,才能促使并维持HBeg/HBeAb血清转换,甚至产生HBsAg/HBsAb血清转换,直至完全清除HBV。TRAIL作为机体的一个典型的免疫监视分子,它于1995年Wiley等[5]首次发现并克隆成功,为继TNF、FasL之后发现的第三个TNF超家族的凋亡分子。TRAIL诱导细胞凋亡的调控主要是通过严格的受体表达来实现的[6,7]。2003年Mundt等[8]在腺病毒感染鼠肝炎模型中发现,病毒感染可激活TRAIL并诱导细胞凋亡,推测TRAIL诱导细胞凋亡可能在病毒性肝炎中发挥重要作用。Han等[9]检测HBV感染患者血清,发现sTRAIL水平与疾病状态和病情轻重密切相关,也认为sTRAIL参与了病毒感染的肝细胞凋亡。有体外实验报道TRAIL系统参与了乙型肝炎患者外周血淋巴细胞活化诱导细胞死亡（activation induced celldeath,AICD）的过程,其中TRAIL-R2与TRAIL-R3可能起主要调控作用[10]。IFN-γ是病毒感染激活机体的免疫系统后释放的非常重要的细胞因子,实验证明IFN-γ可以促进淋巴细胞及单核细胞等炎性细胞TRAIL的表达及sTRAIL的释放[11,12]。本实验对核苷类似物抗病毒治疗早期出现病毒学应答的CHB血清sTRAIL水平进行了动态检测,同时还检测了IFN-γ、ALT,并进行相关分析。结果表明,CHB血清中sTRAIL、IFN-γ、ALT水平较正常人明显升高,说明sTRAIL在IFN-γ的作用下,一方面能够及时清除突变细胞和转化细胞;另一方面sTRAIL在杀伤靶细胞的同时也有可能进一步加剧肝脏的损伤,sTRAIL介导的细胞凋亡是肝细胞损伤的重要机制之一。结果还显示,核苷类似物抗病毒治疗24周病毒学应答者,sTRAIL水平降低,IFN-γ水平提高,ALT恢复正常,sTRAIL水平与IFN-γ水平、ALT水平具有直线相关性,也说明可能随着治疗后病毒载量下降,TRAIL及TRAIL-R表达减少或消失,sTRAIL介导的细胞凋亡受到遏制,尤其是淋巴细胞AICD受到遏制,淋巴细胞功能恢复正常,提高了机体的特异性免疫反应,进一步有利于病毒的清除,即sTRAIL在其免疫恢复中也起重要作用。国内也有学者报道核苷类似物抗病毒治疗能使机体免疫部分恢复或增强[13]。结果还发现核苷类似物抗病毒治疗24周,出现病毒学完全应答者,在疗程的第4周末sTRAIL水平就明显下降,提示sTRAIL可能较其它指标更敏感地反映患者的免疫功能恢复情况及治疗效果,也提示根据早期的sTRAIL变化能预测远期疗效和调整治疗方案。

总之,本研究结果部分证实了sTRAIL在HBV感染所致免疫损伤中扮演重要角色,同时作为是机体的一个典型的免疫监视分子,通过sTRAIL水平的变化了解核苷类似物抗病毒治疗早期患者免疫恢复或增强情况,以最终达到HBeAg血清转换,甚至HBsAg血清转换。sTRAIL有可能作为核苷类似物治疗早期应答指标预测远期疗效。然而,核苷类似物抗乙肝病毒免疫效应机制是复杂的,关于TRAIL在其中的作用还需要进一步深入研究,如对膜表面TRAIL（mTRAIL）的研究、对TRAIL受体（TRAIL-R）的研究、TRAIL与HBeAg血清转换及HBsAg血清转换的相关研究等,以利充分发挥TRAIL的免疫监视作用,使抗病毒治疗能达到理想的治疗终点。

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[收稿2009-07-02 修回2009-11-04]

（编辑 倪 鹏）

The study of the sera TRAIL levels in chronic hepatitis B patients treated w ith Nucleoside analogues

WEIPing,WANGHua,ZENGLing-Lan,ZHULi.InstituteofInfectiousDiseases,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Objective:To study the sTRAIL levels in chronic hepatitis B（CHB）patients upon nucleoside analogues therapy.Methods:Serial seraof60 CHB patients before and after nucleoside analogues therapy were collected,among which there were 20 complete responding cases,20 partial responding cases,20 non-responding cases,and 10 healthy people.The level of sTRAIL,IFN-γand ALT were detected.Results:The level of sTRAIL,IFN-γand ALT of CHB patientswere higher than thatof normal group.The sTRAIL level of complete responding group at4weeks and partial responding group at 12 weekswere lower than those before therapy,while serum TRAIL of comp lete responding groupwere lower than those of partial responding group at4 weeks.The IFN-γlevel of complete responding group at4 weeks and partial responding group at12 weekswere higher than those before therapy.ALT levels ofallgroupsin the courseof therapy declined gradually and significant difference was observed atdifferent time point.Conclusion:Serum TRAIL level can beused as an earlymarker for efficacy of nucleoside analogues therapy efficacy in CHBpatients.sTRAILmay play a role in restoring immune injury of early anti-viral response in patientswith hepatitis B.

sTRAIL;Chronic hepatitis B;Nucleoside;Early anti-viral response

R512.6+2

A

1000-484X（2010）02-0174-04

①华中科技大学同济医学院附属协和医院传染病实验室,武汉430022

②华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室,武汉 430022

魏 屏（1958年-）,女,副教授,主要从事传染病研究。

·实用临床免疫学·