黄芪多糖对哮喘小鼠特异性免疫治疗的增强作用①

宋泽庆 林朱艳芬 （广东医学院附属医院呼吸内科,湛江 524000）

黄芪多糖对哮喘小鼠特异性免疫治疗的增强作用①

目的:探讨黄芪多糖（Astragalus Polysaccharide,APS）对哮喘小鼠特异性免疫治疗（Specific Immune Therapy,SIT）的影响及其可能的作用机制。方法:90只4～6周龄SPF级BALB/c小鼠,随机平均分为空白对照组、哮喘模型组、SIT治疗组、APS治疗组、APS和SIT单纯联合治疗、APS和OVA混合液治疗组等 6组;用OVA致敏,分别用SIT、APS及两者联合等方法治疗,用1%OVA雾化吸入激发;最后一次激发24小时后处死小鼠,进行BALF细胞计数;HE染色观察肺组织切片炎症细胞浸润程度;ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4。结果:SIT、APS及两者联合治疗组肺组织炎症细胞浸润程度减轻,BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞数减少,血清IFN-γ水平上升,IL-4水平下降,联合治疗组比分别治疗组明显。结论:APS可增强SIT的效果,其机制可能是通过影响IFN-γ、IL-4分泌水平实现。

支气管哮喘;特异性免疫治疗;黄芪多糖;Th1/Th2

支气管哮喘（简称哮喘）是一种常见病、多发病,已成为全球性的社会卫生问题,对人类的健康构成了严重威胁。哮喘的病理学改变以气道嗜酸性粒细胞浸润为主,肥大细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润为辅,以气道炎症诱发的气道高反应性和气道通气障碍为主要临床特征。近20多年来以慢性抗炎治疗为主的治疗已可以有效地通过抑制气道炎症来控制哮喘的临床症状,但哮喘的发病率和死亡率并没有降低,而特异性免疫治疗（Specific Immune Therapy,SIT）是对过敏性哮喘进行有效病因治疗的方法之一,对于IgE介导的变态反应疾病患者来说,过敏原特异性免疫治疗具有很好的效果[1,2]。SIT的作用机制在于调节Th1/Th2的平衡。近年国内外的研究都表明卡介苗及其衍生物可作为非特异性免疫调节剂来调节机体免疫和Th1/Th2平衡[3],与SIT联合治疗哮喘能更好地使IL-4分泌水平降低、IFN-γ分泌水平升高,将免疫应答调节为Th1细胞呈优势应答[4]。黄芪多糖（Astragalus Polysaccharide,APS）提取自补益中药黄芪,可使免疫功能低下小鼠下降的IFN-γ水平提高,通过IFN-γ分泌从而抑制 IL-4表达,使Th0细胞向Th1细胞分化[5]。本研究拟观察APS对哮喘小鼠SIT的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Ovalbumin GradeⅡ购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司,Astragalus Polysaccharide Injectable Powder购自美国泛华医药公司,小鼠IL-4、IFN-γELISA试剂盒购自美国Biosource生物工程公司。其余试剂均为市售分析纯试剂。

1.2 实验动物 90只 4～6周龄SPF级BALB/c小鼠,雌雄各半,体重16～20克,由广东医学院实验动物中心提供。

1.3 致敏、药物干预、激发小鼠 参考张力江[6]模型制作方法,并根据本实验做适当调整。将90只小鼠随机分为6组,每组15只。A组:空白对照组;B组:哮喘模型组;C组:SIT治疗组;D组:APS治疗组;E:APS、SIT单纯联合治疗组;F组:APS、OVA混合液治疗组 。B、C 、D、E、F 组分别于第 1、3、5、7、9、11、13天经小鼠腹腔及后肢内侧皮下注射辅以氢氧化铝的OVA致敏液（0.75mg/kg）,每次腹腔0.4ml,皮下0.1m l,共0.5ml;再分别于第33、35、37天经后肢内侧皮下注射氯化钠注射液、SIT治疗液（OVA 50 mg/kg）、APS溶液（APS 200mg/kg）、APS溶液和SIT治疗液（左右后肢分别注射）、OVA与APS混合液（OVA 50 mg/kg,APS 200mg/kg）各 0.1m l;第 45 天时,以1%OVA进行雾化吸入,使小鼠暴露在OVA气雾中30分钟,每天1次,持续7天。A组以等量生理盐水腹腔注射、雾化吸入和后肢内侧皮下注射。

1.4 标本制备 各组小鼠最后一次激发24小时后,腹腔注射10%水合氯醛（0.6 g/kg）麻醉,摘眼球取血液约1ml,3 500 r/min离心10分钟,收集血清,-70℃保存备用。取血后处死小鼠,打开胸腔,结扎左肺,行气管切开插管,用生理盐水灌洗右肺,每次1m l,共3次,收集支气管肺泡灌洗液（BALF）,回收率大于80%。采集BALF后,剪取结扎的左肺,置10%福尔马林溶液中。

1.5 肺组织病理学检查 小鼠左肺组织置于10%福尔马林溶液中固定,梯度乙醇脱水后浸蜡、包埋,5μm连续切片,进行HE染色、封片,光学显微镜下观察肺组织病理学变化。

1.6 BALF细胞计数及血清IFN-γ、IL-4测定 BALF细胞计数采用直接计数法。细胞总数用3%乙酸溶液稀释后进行计数,嗜酸性粒细胞用丙酮-伊红稀释液稀释后进行计数。用ELISA法测定血清IFN-γ、IL-4水平。

1.7 统计学分析 实验数据采用SPSS16.0软件进行统计,对各组数据先进行正态检验和方差齐性检验,若符合正态分布且方差齐则用完全随机设计方差分析及LSD法进行检验,所得结果均以±s表示;否则行秩和检验,所得结果用中位数±四分位间距表示。

2 结果

2.1 症状观察 观察各组小鼠雾化吸入OVA致敏液后激发反应。激发约10分钟后小鼠开始出现鼻煽、呼吸加快加深、点头呼吸、偶尔咳嗽、烦躁、前肢缩抬等表现,取出动物可见遗留较多排泄物,提示引喘成功。激发过后,小鼠精神萎靡,毛发不顺,食欲下降。各治疗组小鼠精神及毛发状态24小时内会有所恢复,食欲较模型组好。各治疗组小鼠后肢均无明显皮肤组织损伤、溃疡,也无瘫痪现象。空白对照组一般情况良好。

2.2 肺组织病理变化 空白组为正常肺组织表现,见图1A。哮喘组可见支气管管腔变形、狭窄,管壁增厚,部分脱落上皮细胞脱落,杯状细胞明显增多,支气管粘膜及粘膜下层组织有大量炎性细胞浸润,肺泡间质增厚,其中可见多量炎性细胞,见图1B。SIT治疗组支气管形态基本正常,支气管粘膜及粘膜下、肺间质可见炎性细胞浸润,见图1C。APS治疗组可见支气管管腔变形、狭窄,管壁增厚,肺泡间质增厚,炎性粒细胞浸润,但程度较 B组轻,见图1D。单纯联合治疗组和混合液治疗组两组可见支气管管腔形状基本规则,无明显狭窄,支气管粘膜及粘膜下、肺泡间质可见少量炎性粒细胞浸润,病变程度较轻,形态与A组接近,见图1E、F。

图1 OVA致敏小鼠气道重构的病理改变（HE×200）Fig.1 The pathological changes of lung inm ice sensitized by OVA（HE×200）

表1 小鼠BALF中细胞总数计数和嗜酸细胞计数的变化（±s,×108 L-1）Tab.1 Total cell count and EOS count of BALF from the m ice（±s,×108 L-1）

表1 小鼠BALF中细胞总数计数和嗜酸细胞计数的变化（±s,×108 L-1）Tab.1 Total cell count and EOS count of BALF from the m ice（±s,×108 L-1）

Note:1）vs Control group,P＜0.01;2）vs Asthma group,P＜0.05;3）vs SIT group,P＜0.05;4）vs APS group,P＜0.05.

Groups n Total EOS Control 15 12.00±12.00 1.50±1.50 Asthma 12 44.00±29.501） 11.00±7.381）SIT 15 22.50±20.002） 4.50±4.002）APS 15 27.60±22.502） 5.50±4.502）SIT+APS 15 17.50±17.502）3）4） 2.50±2.502）3）4）SIT-APS 15 15.50±28.002）3）4） 1.50±4.002）3）4）

表2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量变化（±s,ng/ml）Tab.2 The levels of IFN-γand IL-4 in serum from m ice（±s,ng/m l）

表2 小鼠血清IFN-γ、IL-4含量变化（±s,ng/ml）Tab.2 The levels of IFN-γand IL-4 in serum from m ice（±s,ng/m l）

Note:1）vs Control group,P＜0.01;2）vs Asthma group,P＜0.01;3）vs SIT group,P＜0.01;4）vs APS group,P＜0.05.

Groups n IFN-γ IL-4 Control 15 127.63±17.95 34.70±7.18 Asthma 12 47.49±10.791） 54.96±9.901）SIT 15 77.81±9.871）2） 43.60±7.021）2）APS 15 74.71±6.151）2） 47.55±4.641）2）SIT+APS 15 96.15±4.721）2）3）4） 42.41±3.871）2）4）SIT-APS 15 98.17±5.051）2）3）4） 40.80±4.321）2）4）

2.3 BALF细胞计数 B组炎性细胞和嗜酸细胞计数较空白组都有显著增加;SIT组、APS组以及SIT和APS联合治疗的两组细胞计数较哮喘组均明显减少,SIT和APS联合治疗的两组细胞计数较SIT和APS单独治疗组也有明显减少,均有统计学意义（见表1）。

2.4 血清IFN-γ、IL-4水平 B组较A 组IFN-γ显著降低,而IL-4显著升高;SIT组、APS组以及SIT和APS联合治疗的两组较哮喘组IFN-γ明显升高,IL-4明显降低,SIT和APS联合治疗的两组较SIT和APS单独治疗组IFN-γ明显升高,IL-4明显降低（见表2）。

3 讨论

本课题用OVA致敏、激发制作哮喘小鼠模型。在激发过程中可观察到哮喘组小鼠有呼吸困难、烦躁等症状;肺组织病理切片可见到支气管管腔狭窄,管壁增厚,大量炎性细胞浸润;肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞数比空白组明显增多,提示模型塑造是成功的。哮喘组与空白组比较,血清中特征性Th1型细胞因子IFN-γ水平降低、特征性Th2型细胞因子IL-4水平升高,Th1/Th2比例降低,Th2细胞呈优势应答,Th1/Th2失衡,此结果与哮喘发生机制一致。

哮喘发生过程中,变应原通过粘膜被抗原提呈细胞如B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等识别而捕获,发生免疫应答,在血液中和其他部位变态反应转向选择性Th2淋巴细胞应答,而特异性Th1淋巴细胞亚群的数量则减少,活性降低,使Th1/Th2失衡。研究证明SIT可同时作用于抗原提呈细胞和T细胞,纠正细胞因子失衡来逆转Th1/Th2平衡失调[7,8]。本课题中,对OVA致敏的小鼠进行SIT,随后激发,也出现呼吸困难等症状,但程度比哮喘组轻;肺组织切片炎性细胞的浸润程度比哮喘组轻;BALF中细胞总数和嗜酸性粒细胞数也比哮喘组大大减少。SIT对哮喘有明显的治疗作用。而且,与哮喘组比较,IFN-γ明显升高,IL-4明显下降,提示SIT有上调Th1细胞功能和下调Th2细胞功能的作用,从而调节了Th1/Th2的失衡。

APS作为一种免疫增强剂,在临床上已经应用于体质差免疫力低下的病人,并取得较好的辅助治疗作用,而且其调节Th1/Th2失衡文章已多有报道。因此我们试图探究出APS对哮喘治疗作用并看其是否能增强SIT对哮喘的免疫治疗作用。在本课题中,从激发症状、肺组织病理表现、肺泡灌洗液细胞总数和嗜酸性粒细胞数、以及血清IFN-γ、IL-4水平等这些方面,APS组与哮喘组的比较结果提示APS也可以通过刺激IFN-γ分泌,提高Th1应答水平,抑制IL-4分泌,降低Th2应答水平。SIT、APS联合治疗的E、F两组,从激发症状、肺组织病理表现,肺泡灌洗液中细胞计数以及血清细胞因子检测都提示SIT、SPA联合应用对哮喘有治疗作用,且效果比单用好,证明SPA能增强SIT免疫治疗作用;联合应用与单独应用比较,主要体现为上调Th1细胞功能的作用增强,但是两种联合的方式间没有显著差异。

国外一些研究证明:用生物素、亲和素将卡介苗衍生物和OVA偶联起来后可以诱导出比单独应用更强的免疫应答效应[9]。因此,我们也可以在后续研究中,探讨APS与OVA的偶联方法,用偶联后获得的APS-OVA进行动物实验观察其效果是否能超越单纯联合应用,并探讨其机制,这些可以为开发哮喘蛋白疫苗奠定理论依据。

1 Novembre E,Galli E,Landi Fetal.Coseasonal sublin-gual immunothe rapy reduces thedevelopmentofasthma in children with allergic rhinocon-junctivitis[J].JAllergy Clin Immunol,2004;114（4）:851-857.

2 张忠芳,何韶衡.变态反应疾病免疫治疗机制的研究进展[J].广东医学,2006;27（9）:1410-1412.

3 Carcia-Marcos L,Suarez-VarelaM M,Canflanca IMetal.BCG immunization at birth and atopic diseases in ahomogeneous population of Spanish school children[J].Int A rch A llergy Immunol,2005;137（4）:303-309.

4 王成秀,符 洲,周 娟.卡介苗多糖核酸和特异性免疫治疗对哮喘儿童免疫功能的影响[J].免疫学杂志,2005;21（1）:61-63.

5 颜培宇,于晓红,张德山etal.黄芪多糖注射液对免疫功能低下小鼠血清IL-4和IFN-γ影响的实验研究[J].内蒙古中医药,2007;10（26）:35-36.

6 张力江,陈卫强,田 琼etal.中药蓝玉簪颗粒对慢性哮喘小鼠气道重建的影响及机制[J].第四军医大学学报,2007;28（21）:1933-1936.

7 Anals P,Karine B,Domitille Petal.A llergen-specific immunotherapy in allergic rhiniti and asthma.Mechanismsand proofof efficacy[J].RespiratoryMedicine,2009;103（6）:800-812.

8 Giovanni P,Stephen R,Durham M D.A llergic rhinitisand its impact on asthma update:allergen immunotherapy[J].JAllergy and Clinical Immunology,2007;119（4）:881-891.

9 ShirotaH,Sano k,kikuchiTetal.Regulation of T-helperType2 celland airway eosinophilia by trans mucosal coad-ministration of antigen and oligode oxynucleotides containing CpGmotifs[J].Am J Respir Cell Mol Bio,2000;22（2）:176-182.

[收稿2009-07-17 修回2009-12-07]

（编辑 倪 鹏）

The enhancement of Astragalus Polysaccharide on specific immunotherapy in asthmaticmouse

SONGZe-Qing,LINLin,ZHUYan-Fen.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicine College,Zhanjiang524000,China

Objective:To explore theeffects the of AstragalusPolysaccharideon specific immune therapy in amousemodel of asthma.Methods:Ninety SPF（Specific pathogen Free）BALB/c micewere random ly divided into six groups.The experimental groupswere sensitized with OVA,treated with SIT or APS or their joint application.Then them icewere excited with 1%OVA.24 hours after the last excition,the numbers of the total inflammation cells and esoinophils（EOS）in BALF were counted.The left lung tissueswere used to perform histological analysis.IFN-γand IL-4 in peripheral blood were analysed by ELISA.Results:After the therapy,asthma-associated lung inflammation was inhibited,and the numbers of total cells and EOS decreased.IFN-γlevelwas raised and IL-4 levelwas lowered.Conclusion:APS can enhance SIT.Itmay resu lt from affecting production of both the IFN-γand IL-4.

Asthma;SIT;APS;Th1/Th2

R392.8 R562.2+5

A

1000-484X（2010）02-0132-04

①本文为广东省中医药管理局课题（No.2050013）

宋泽庆（1956年-）,男,主任医师,硕士生导师,主要从事呼吸内科相关疾病方面研究,E-mail:zeqingsong@yahoo.com。

·启事·