物理实验中的显微摄影实验

李维晖,张 宏,陈 新

(北京理工大学物理实验中心,北京100081)

1 引 言

随着科学技术的迅速发展,物理实验中的黑白摄影技术已经逐步退出实验教学,取而代之的是数码摄影及计算机图像处理技术,为了使学生能在实验室系统地学习这些技术,我们将光学显微摄影引入了实验室.显微摄影在生物、医学、材料等研究领域有着广泛应用,它已成为了科学家研究的另一只“眼睛”.按照国际摄影界中公认的说法,拍摄达到10∶1～200∶1左右影像比例属于显微摄影的范畴.

显微摄影一般是借助于光学显微镜在目镜处配上数码相机或摄影镜头,使来自物体的光线经过物镜和目镜的配合后到达数码相机或摄影镜头上,形成放大数倍或数百倍于原物大小的影像进行拍摄.在显微摄影时应该注意一些实际操作问题,来提高拍摄效果.

2 显微摄影前的准备工作及基本步骤

显微摄影之前需要对显微镜进行摄影前的基本调节,首先认真检查显微镜的物镜、聚光镜安装定位是否正确,然后调节目镜的两眼瞳距和校正屈光度.调节方法是用1只眼通过调节摄像目镜上的屈光调节环,使目镜视野中心的“十”字由单线变成清晰的双线,如图1所示.显微摄影的基本步骤如下:

1)首先将被拍切片置于显微镜载物台上,打开照明系统.

图1 屈光度校正

2)用较小倍率如4×或10×物镜调准焦点,目的是确定载物台的位置.

3)再将台下聚光镜的孔径光阑与视场光阑收缩到最小位置,此时视野中出现多边形影像.

4)“下调焦”.用台下聚光镜的升降旋钮,上下移动聚光镜,使视场光阑的影像清晰地呈现在标本平面上.

5)光学合轴.调节光学旋转台下聚光镜上的2个定心旋钮,将视场光阑的影像调整到视野中心位置处,聚光镜的位置应固定不动.

6)调整视场光阑和孔径光阑.

7)调焦观察.在照明观察标本时,使视野内见不到灯丝的影像,整个视野内亮度要非常均匀,而均匀的照明是显微摄影时重要条件之一.

3 光学显微镜的用光

在使用光学显微镜摄影时,要注意光源的调节和色温的变化,同时还要有明亮、均匀、无反光的照明系统.另外,要根据样品的性能差异,选用不同的照明方法来拍摄.

3.1 光源的选择

在明视场照明显微摄影时,一般选择色温在2 700～3 200 K之间,6 V或者12 V螺口形白炽钨丝灯泡做照明光源,其亮度的调整由变压器实现,由于这种光源在照明时看上去很亮,但实际色温并不高,所以要尽量用最高电压,使灯光亮度、色温提高,并使用RAW格式拍摄,以便后期校正色温.

长期使用的白炽钨丝灯泡,钨丝蒸发后会在玻璃罩内壁积聚一些沉物,会使白炽钨丝灯泡的亮度与色温降低,因此,光学显微摄影的优质光源一般选用12 V 1 00 W灯管内充满卤素气体的卤素钨丝灯.在灯丝点燃后,卤素钨丝灯蒸发出来钨会与卤素气体形成卤化钨,附着在灯管内壁;而关闭电源冷却时,卤化钨又会分解,钨又回到灯丝上去,这样就改善了光源照明,提高了光源强度,使灯泡的寿命延长了,同时也缩小了灯泡的几何尺寸.

3.2 光学显微摄影的用光方法

拍摄显微照片时,照明方法可分为2种:透射光照明,如图2所示,光源射出的光线从标本的下面透过标本进入物镜;反射光照明(落射光照明),如图3所示,光线从正面投射到标本的正面,而透过物镜接收到的光是从标本反射来的光.

图2 透射光照明光路

图3 反射光照明(落射光照明)光路

透射光照明通常用于拍摄透明标本,而落射光照明主要用于拍摄不透明的标本,如植物果实表面、皮肤、小生物等,拍摄后的相片具有一定的立体感.在使用落射光拍摄时,光线与物镜光轴之间的角度越小越好,现在的显微镜装置中落射光大多与物镜合轴.本次实验所用显微镜为XSP-BM13C三目落射式荧光显微镜,它具有透射式和落射式照明系统.

4 光学显微摄影影响曝光的因素

1)由于光源电压的波动会引起曝光量的改变,光源强度对曝光的影响,可能产生5～10倍的亮度变化,所以在摄制过程中要保持电压的相对稳定.

2)光源的波长及色温对曝光会产生影响.光源的波长较长、色温低,色光偏红时,曝光时间要长些;光波较短,色温高,色光偏青时,曝光时间要短些.

3)聚光镜光阑孔径的大小变化能使曝光产生2～20倍的变化.

4)被拍摄物质的介质折射率对曝光时间的影响.曝光时间与折射率成反比,如果标本与目镜间的介质折射率大、曝光时间短,反之,曝光时间长.

5)滤色镜、乳白玻璃、偏振镜对曝光时间的影响.如果使用滤色片等要按其曝光指数增加曝光时间(可选用手动曝光).

6)其他因素对曝光时间的影响,如目镜的放大率、物镜的倍率和NA值、从目镜出射点到感光片的距离、标本的染色等也会对曝光产生一定的影响.

5 摄影中应注意的问题

5.1 标本的聚焦要准确

显微摄影观察的是肉眼无法观察的标本,因此,观察拍照时的调焦要非常仔细,稍不留意就可能聚焦不清晰.特别是用高倍镜观察时由于其景深比较小,聚焦更是困难.实验中应该手眼配合,耐心调节.

5.2 视场光阑的调节

视场光阑的主要作用是调节视场照明范围.在显微摄影时,如果视场光阑过大,照射到被摄物体上的光超过视场直径,视场以外的光线经玻璃和标本的反射和不规则的散射,造成影像反差的减弱,降低了影像的清晰程度.反之,光阑收缩过小,其照明范围小于视场直径时,视野四周被遮挡,不能观察和拍摄到全部物像.在显微摄影时,视场光阑还应适当缩小,视场光阑的像比摄影范围标记略大即可.

5.3 孔径光阑的调节

聚光镜除了将光源投射来的光有效地聚焦在被检标本上外,还通过聚光镜孔径光阑的调节产生与物镜相适应的光束,使图像的反差和景深处于最佳状态,也就是说,聚光镜孔径光阑具有控制拍摄标本景深范围的作用,这与普通照相机镜头中光阑的作用是相似的.因此,聚光镜的孔径光阑与显微照片的反差和清晰度有直接关系.

一般的原则是当物镜的放大倍率增大时,聚光镜的孔径光阑也应相应增大以提高视野亮度,但这是以减小景深为代价的.在显微摄影中,大多数被检物体要想得到高质量照片,聚光镜的孔径光阑要调节在数值孔径的60%～80%,至于具体调节多少要根据具体图像的反差而定,开大了照片反差降低,开小了图像分辨率将受影响.所以有经验的摄影者可以一边观察调焦目镜中的图像,一边调节孔径光阑,直到影像的反差、景深和清晰度处于最佳状态时为止.

5.4 合理使用滤色片

在拍摄过程中,加入滤色片对图像的对比度、色调、饱和度等都有很大的影响.对于一个特定的观察目标,选择合适的滤色片对图像的观察具有重要意义.在显微镜下用肉眼观察某一标本时,观察到的色彩丰富,但拍摄出来的相片色彩却非常平淡,特别是黑白摄影.目前依然以黑白显微摄影为主,但重要的问题是缺乏对比.为了获得高清晰度的形态分析照片,在生物标本的制作中为了使各种组织容易区别,大部分是用不同的化学方法进行染色,以伪彩效果来观察其结构形态,着重对某一颜色标本的形态进行分析.

滤色片在拍摄中对什么样的标本几乎都是有用的.为了使照片达到突出某色图像的效果,曝光前在光源上加上此色的补色滤色片即可.由于滤色片的使用使白光变为某一波长的单色光,不同色光的波长其折射率有所区别,使用不同颜色的滤色片,光线经过聚光镜会聚的情况即有差异,聚光镜都应作相应的上下调整,即应重新调整照明系统.除性能极好的复消色差的聚光镜外.如使用红色长波滤色片时聚光镜应适当下降;而使用蓝色短波滤色片时聚光镜则应酌情上升.

6 结束语

随着实验条件的不断完善,可以进一步提高显微摄影技术,通过显微摄像观察、拍摄微生物、细胞变化等动态过程.显微摄影无论是在科学研究方面还是在艺术摄影方面都有着广泛的应用,学生经过学习显微摄影技术,不仅可以学到相关的理论知识,掌握显微摄影这门技术,更能积累丰富的实践经验,逐步提高拍摄水平.

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