浓缩六味地黄丸中马钱苷的药代动力学研究

戴 冰， 肖子曾， 梅 君， 冷 旺， 李兴丰， 赵 婧， 廖建萍， 彭 柳

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007;2.湖南中医药大学，湖南长沙410007)

六味地黄丸为棕褐色的浓缩丸，味微甜、酸、略苦，它是由六味中药材组成:熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻。诸药配伍，共奏滋阴补肾，用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热 、盗汗遗精、消渴［1］。其有效成分主要有苷类，如芍药苷、马钱苷、地黄苷等;酚性成分，如丹皮酚等;萜类，如泽泻醇 A、B、C等及一些有机酸如没食子酸、熊果酸等［2］。其中马钱苷为2010版《中国药典》收载的六

味地黄丸指标成分之一，近年来对六味地黄丸中马钱苷的研究较多［3-7］，但大多集中在体外成分含量测定方面，其体内药代动力学研究鲜有报道。本研究在参考体外研究的基础上，采用反相高效液相色谱法测定大鼠血清中马钱苷的浓度，研究大鼠灌胃给药后的体内药代动力学特点，这对临床合理用药及剂型的改进都将具有指导意义，同时为中药复方的物质基础研究也提供了新的思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱仪(包括四元梯度泵、真空脱气机、Chemstation software工作站，SPD-10AVP二极管阵列检测器)，DT-100电子分析天平(北京光学仪器厂)，DL-360A超声清洗机(上海之信仪器有限公司);MILLI-QB纯净水发生器(美国MILLIPORE公司)。

1.2 试药 浓缩六味地黄丸(批号:20080115，九芝堂股份有限公司);戊巴比妥钠(批号:86-01-22，上海化学试剂采购供应站分装厂);马钱苷标准品(河北医科大学药学院天然药物化学教研室，白色粉末，纯度＞99.5%);乙腈(色谱纯)、磷酸(分析纯)、甲醇(色谱纯)、乙醇(色谱纯)、双蒸水。

1.3 实验动物 健康Wistar大鼠，清洁级，♀♂各半，体重(200±20)g，湖南农业大学实验动物中心提供，合格证号:医动字第20-002号。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);Nova-Pak C18Guard-PakTM保护柱。流动相:0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B);检测波长:236 nm;柱温:30℃;流速:1 mL/min;分析时间55 min，洗脱梯度见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 供试品溶液的制备 取六味地黄丸400丸(每8丸相当于生药材量3 g)，加纯净水约300 mL，搅拌，煮沸，使其药液浓缩至0.6 g/mL(按生药材含量计)，供实验用。

2.3 对照品溶液的制备 取马钱苷对照品适量，加空白大鼠血清溶解，马钱苷浓度为210 μg/mL，临用前用空白血清稀释至各所需浓度。

2.4 血清样品的制备 大鼠按20 mL/kg给予供试品灌胃后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经肝门静脉取血5 mL，静置4 h，3 000 r/min离心15 min，取上清液1 mL，加入0.2 mL 70%高氯酸，快速摇匀，3 000 r/min条件下离心15 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，备HPLC分析，血清-20℃冷冻保存，供实验用［8］

2.5 药动学试验 取Wistar大鼠，清洁级，♀♂各半，体重(200±20)g。按20 mL/kg给予供试品灌胃，给药后分别于不同时间(0、5、10、15、30、45、60、120、180、240、360、450 min)肝门静脉采血，每个时间点6只大鼠。取血后按2.4项下方法制备含药血清，进样20 μL，测量色谱峰面积，计算血药浓度。

2.6 色谱系统适应性试验

2.6.1 方法确证 在上述色谱条件下，马钱苷的分离效果好，空白血清中的内源性物质及其代谢产物，含药血清中的其他物质成分均不干扰测定。理论塔板数不小于4 000，保留时间约为42.5 min。空白血清，空白血清中加入马钱苷对照品，含药血清及含药血清加入马钱苷对照品色谱图，见图1。

图1 空白血清、对照品、含药血清HPLC图

2.6.2 标准曲线绘制 对照品溶液用空白血清稀释成浓度分别为 2.6、5.2、10.5、21、42 μg/mL 的溶液，进样10 μL，以峰面积积分值为纵坐标，进样量(ng)为横坐标做标准曲线，求得回归方程，马钱苷回归方程为:Y=1.092 1X+27.064，r=0.999 1，线性范围:26～420 ng。

2.6.3 精密度试验 取同一浓度的对照品溶液，重复进样5次，马钱苷平均峰面积RSD为1.27%，结果表明:仪器精密度良好，符合体内药物浓度测定的要求。

2.6.4 回收率试验 按2.3项下方法制备不同浓度含药血清标准液，经测定，不同浓度下均有高而稳定的回收率，各浓度回收率符合体内药物浓度测定的要求，RSD为4.01%，结果见表2。

表2 回收率试验结果

2.6.5 稳定性试验 取空白血清，加入适量标准品，配置成终浓度为55.0 μg/mL马钱苷血清样品，分别于 2、4、6、8、24 h 分别进样分析 1 次，连续测定5次，计算RSD(变异系数)值，RSD=0.55%，表明:血清样品24 h内稳定性良好。

2.7 药动学参数 大鼠灌胃后，分别于不同时间点测定马钱苷的血药浓度。采用3P97药动学软件进行自动拟合处理。以理论血药浓度值与实际测定值的相关系数最大和AIC最小作为判断标准，权重1/C。结果马钱苷的药动学曲线经拟合符合一室模型，主要药动学参数见表3，平均血药浓度-时间曲线见图2。

表3 灌胃给药后马钱苷的主要药动学参数

3 讨论

图2 平均血药浓度-时间曲线(n=6，±s)

3.1 马钱苷为2010版《中国药典》收载的六味地黄丸指标成分之一，近年来对六味地黄丸中马钱苷的研究较多［3-7］，但大多集中在体外成分含量测定方面，其体内药代动力学研究鲜有报道。本研究在体外研究的基础上，采用反相高效液相色谱法测定大鼠血清中马钱苷的浓度，研究大鼠灌胃给药后的体内药代动力学特点，这对临床合理用药及剂型的改进都将具有一定的指导意义。

3.2 本研究以血药浓度法作为手段，采用高效液相色谱技术，在参考有关文献［7］的基础上建立了适合本研究的色谱条件和血清样品制备方法。通过比较空白血清、空白血清加马钱苷对照品、六味地黄丸含药血清以及六味地黄丸含药血清加马钱苷对照品的色谱图，可很好地对六味地黄丸含药血清中的马钱苷进行定性分析;且能将大鼠血清中目标成分与血清中蛋白杂峰、内源性物质、六味地黄丸的其他成分以及这些成分的体内代谢产物和结合性成分很好分离。此方法重现性好，操作程序简便，为相关制剂中马钱苷的入血分析提供参考。

3.3 检测波长的选择 本实验采用二极管阵列检测器，在分析时进行200～400 nm紫外扫描，确定马钱苷在236 nm有最大吸收，故选用236 nm作为检测波长。

3.4 色谱条件的优化 实验中考察了不同系统的流动相进行梯度洗脱筛选试验，包括:①乙腈-水溶液②甲醇-水溶液③乙腈-0.05%磷酸水溶液④甲醇-0.05%磷酸水溶液多个梯度洗脱系统作为流动相进行考察。结果表明:乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱系统最佳，色谱峰峰型好，各色谱峰分离度高，保留时间适宜，故选用该流动相系统作为六味地黄丸含药血清含量测定的洗脱系统。

3.5 由于中药复方所含成分的复杂性，口服后有效成分含量偏低，经制剂处理，服用时胃肠道的选择性吸收及肝脏的首过效应等原因，其在血液中的含量大大减少，经HPLC分析时难以检出，故本研究采用肝门静脉采血法，因为经肝门静脉采血具有原型入血成分血药浓度较高(药物经消化道吸收，尚未被肝脏代谢)、操作简便、清洁卫生等优点，从而确保目标成分的检出。

3.6 由于考虑到血清沉淀蛋白及过滤进样消耗量大，所以选用大鼠单次采血，这样能保证分析的正常进行，但缺点是会造成个体差异误差较大，本实验选用多个样本重复求平均值的方法减小误差。

［1］李洪珍.六味地黄丸含量测定方法的探索［J］.菏泽医学专科学校学报，2007，19(2):42-43.

［2］曾常青，曾 宇.六味地黄汤中4种有效成分的含量测定［J］.中国医院药学杂志，2007，27(8):1034-1035.

［3］阎东海.HPLC测定浓缩六味地黄丸中马钱苷含量［J］.中国现代中药，2007，9(7):19，23.

［4］冯 堃.HPLC法测定浓缩六味地黄丸中马钱苷含量［J］.郑州大学学报，2008，43(4):790-791.

［5］谭秋红.RP-HPLC法测定六味地黄丸中马钱苷的含量［J］.中国医学工程，2007，15(7):601-602.

［6］唐益华，肖凯华.RP-HPL C法测定浓缩六味地黄丸中马钱苷的含量［J］. 中国药事，2007，21(10):834-835.

［7］谢跃生，张振清.六味地黄汤中马钱子素小鼠体内药代动力学研究［J］.中草药，2002，33(9):548-550.

［8］王喜军，张 宁.六味地黄丸的血清药物化学研究［J］.中国天然药物，2004，2(4):219-222.