单向灌流法研究异甘草素在大鼠体肠吸收

苏 红， 王新春2，*， 黄志巧， 吴培培

(1.石河子大学药学院，新疆石河子832002;2.石河子大学医学院一附院，新疆石河子832008)

异甘草素(Isoliquiritigenin，ISLG)是甘草黄酮中的一种查尔酮［1］，具有抗肿瘤、抗病毒、抗自由基、抑制脂质过氧化等生物活性，能抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌和宫颈癌等多种肿瘤细胞增殖［2-4］，是一种极具开发前景的抗肿瘤药物。因此，鉴于异甘草素较强的药理活性和药用价值，本实验采用在体循环灌流法对异甘草素的吸收动力学进行考察，以期为异甘草素及含异甘草素的中药新剂型的研制提供一定的科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2401PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津);HH-S11-Z型电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂);TDL-S台式离心机(上海安亭仪器厂制造);TG16B型台式高速离心机(中国湖南长沙凯达科学仪器有限公司);T01-100蠕动泵驱动器(保定兰格恒流泵有限公司);电子分析天平(奥豪斯国际贸易有限公司)。

1.2 试剂及试药 异甘草素(实验室自制，HPLC检测为单一成分，纯度为98%);戊巴比妥钠(上海行知化工厂);人工胃液:按中国药典2005年版二部附录XA项下配制:Krebs-Ringe营养液(以下简称K-R缓冲液，自配，每1 000 mL含 NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl20.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，葡萄糖1.4 g);空白肠循环液(K-R缓冲液进行大鼠小肠循环灌注2 h，即得);其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 Wistar大鼠，清洁Ⅱ级，体重(250±50)g，♂性，购自新疆医科大学实验动物中心，合格证号:新医动字第2003-0001号。

2 方法

2.1 肠灌流液中药物浓度的测定

2.1.1 检测吸收波长的选择 取异甘草素对照品适量，用K-R缓冲液配制成适宜浓度，以不含药的K-R缓冲液为空白，在200～800 nm范围进行扫描。结果，异甘草素在395.5 nm有最大吸收，空白在此波长处无吸收，故选395.5 nm为UV法的检测波长。

2.1.2 标准曲线的绘制 取异甘草素约5.0 mg，精密称定，置于25 mL量瓶内，加无水乙醇溶解并定容至刻度，制得浓度为200 μg/mL的贮备液。精密移取贮备液适量，置于50 mL的量瓶中，用K-R缓冲液定容，制得浓度为10 μg/mL的异甘草素溶液。分别精密移取10.0 μg/mL的异甘草素溶液适量，置于10 mL量瓶中，用K-R缓冲液稀释并定容至刻度，制得系列浓度的异甘草素溶液。以K-R缓冲液为空白，于395.5 nm处测定吸收度A。以A对异甘草素质量浓度C进行线性回归，得标准曲线方程为A=0.117 6C-0.000 6，R=0.999 8。结果表明，异甘草素溶液浓度在1.0～9.0 μg/mL范围内，线性关系良好。

2.1.3 精密度实验 分别取浓度为高、中、低3个浓度的异甘草素对照品溶液，1 d内重复测定3次，计算日内精密度;隔天测定1次，连续测定3次，计算日间精密度。结果日内及日间精密度均小于3%。

2.1.4 回收率实验 精密移取异甘草素对照品贮备液，加入K-R缓冲液液稀释成含异甘草素对照品溶液3.0、5.0、7.0 μg/mL 的溶液，于395.5 nm 处测定吸收度A，结果平均回收率为98.65%，RSD为2.11%(n=9)。

2.1.5 异甘草素在空白肠灌流液中的稳定性考察用空白肠灌流液配5.0 μg/mL的异甘草素溶液，置于37℃水浴锅中，并于0、4、6 h测定溶液中异甘草素的含量，根据药物的减少量来考察其稳定性。结果，异甘草素含量在6h内未发生明显变化，表明异甘草素在实验过程中具有较好的稳定性。

2.2 大鼠在体肠灌流实验

2.2.1 大鼠肠灌流实验方法［5-6］为消除实验过程中管路对药物的吸附作用，于实验开始前取供试液反复冲洗实验管道，直至出液口药液浓度与供试液浓度相等。取禁食12 h(可自由饮水)的大鼠，称重，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，于恒温手术台上固定并保持体温。沿腹中线切开腹腔，选择实验肠段，缓缓注入37℃生理盐水将肠道内容物冲净，上端插管，手术线结扎固定，再将伤口用浸有生理盐水的脱脂棉覆盖保湿。将肠段两端的插管与蠕动泵胶管连接形成回路。取37℃供试液以0.5 mL/min的流速泵入肠段，使肠段内充满供试液，再将流速调至0.25 mL/min恒速灌流，约0.5 h。进口处用已知质量的装有供试液的小瓶进行灌流，出口处用已知质量小瓶每隔15 min分段收集流出液，共收集5次流出液，每收集一次迅速精确称定供试液小瓶和收集液小瓶质量。收集结束后，剪下所灌流的肠段，测量其长度(l)和内径(r)。取样品置于1.5 mL离心管中，以 3 000 r/min的速度离心15 min后，用紫外分光光度法测定异甘草素的浓度。

2.2.2 数据处理 小肠不仅吸收药物，也吸收和分泌水份，导致灌流液体积变化，因此，不能用直接测定药物浓度的方法计算药物的吸收。本实验采用重量分析法对灌流液的流入和流出的体积进行校正，消除其体积变化的影响。按下式计算药物吸收速率常数(Ka)和药物表观吸收系数(Papp):

式中Qin和Qout分别为灌入和收集的供试液体积(mL);Cin和Cout分别为进口和出口处缓冲液中的药物质量浓度(μg/mL);l和r分别为被考察肠段长度(cm)和内径(cm);Q为灌流速度(0.25 mL/min);V为被考察肠段的体积;Ka和Papp为最后5个时间段(45～105 min)样品的平均值。

3 结果

3.1 大鼠肠道各区段吸收情况考察 以浓度为5.0 μg/mL异甘草素供试液对大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠组各区段吸收特性进行考察，灌流速度0.25 μg/mL。按2.2.1项的方法操作，计算不同肠段的Ka值和Papp值，进行比较。结果见表1。

表1 异甘草素在大鼠不同肠段的Ka和Papp值(± s，n=5)

表1 异甘草素在大鼠不同肠段的Ka和Papp值(± s，n=5)

肠段 Papp×10-2/(cm/min) Ka×10-1/min十二指肠1.068 1±0.154 7 0.847 2±0.258 1空肠 1.145 3±0.043 2 0.932 2±0.034 2回肠 1.111 4±0.390 6 0.865 2±0.142 3结肠1.560 6±0.272 1 1.305 1±0.119 6

3.2 不同药物浓度异甘草素的肠吸收考察 分别采用1.0、5.0、9.0 μg/mL异甘草素供试液进行空肠段灌流，灌流速度0.25 μg/mL，按2.2.1项的方法操作，考察药物的质量浓度对肠吸收的影响。结果见表2。

表2 异甘草素不同浓度的Ka和Papp值 (±s，n=5)

表2 异甘草素不同浓度的Ka和Papp值 (±s，n=5)

C(μg/mL) Papp/×10-2/(cm·min) Ka/×10-1/min 1 1.263 1±0.064 9 0.916 4±0.192 1 5 1.022 5±0.108 6 1.015 2±0.156 6 9 1.198 6±0.054 6 0.931 5±0.024 5

4 讨论

在吸收面积不变时，在1～9 μg/mL内，随着浓度增加，异甘草素溶液在大鼠小肠的Ka和Papp无显著性差异，符合Fick＇s扩散定律，表明异甘草素主要以被动扩散的方式吸收，所以初步确定吸收机制为被动扩散。

中药有效成分口服吸收特性是中药新制剂新剂型设计处方前研究的重要内容，是提高中药口服给药生物利用度的基础。本实验研究结果表明，异甘草素在整个肠段均有吸收，在各肠段的Ka、Papp是结肠＞空肠＞回肠＞十二指肠，且结肠的Ka、Papp值与其他肠段存在显著性差异(P＜0.05)。因此，研究结果为异甘草素缓释给药系统或结肠定位给药制剂的研究提供了实验依据，对异甘草素口服新制剂的研究具有一定的指导意义。

［1］刑国秀，李 楠，王 童，等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展［J］.中国中药杂志，2003，28(7):593-595.

［2］Kanazawa M，Satomi Y，Mizutani Y，et al.Isoliquiritigenin inhibits the growth of prostate cancer［J］.Eur Urol，2003，43(5):580-586.

［3］Hsu Y L，Kuo P L，Chiang L C，et al.Isoliquiritigenin inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human non-small cell lung cancer A549 cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31(7):414-418.

［4］张 晶，杨 静，汤宏斌.异甘草素对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2005，19(6):436-442.

［5］黄怀鹏，刘 霞.积雪草苷大鼠在体肠吸收动力学研究［J］.中草药，2008，39(7):1056-1058.

［6］吴雅娜，立 标.独活有效成分大鼠在体单向灌流肠吸收［J］.药学学报，2008，43(1):102-107.