大孔树脂纯化买麻藤总茋化合物的工艺研究

袁红宇， 欧 宁， 朱 璇， 吴婷婷

（南京医科大学第一附属医院，江苏南京 210029）

买麻藤Caulis Gnetum为买麻藤科植物买麻藤Gnetum montanumMarkgr.或小叶买麻藤Gnetum parvifoliumWarb.的干燥藤茎，主要分布于两广、云南、海南、福建等地，有平喘、抗过敏、抗蛇毒等药理作用，民间用于治疗风湿性关节痛、腰肌劳损、刀枪伤、蛇咬伤、支气管哮喘和溃疡出血等症［1］。买麻藤中主要含有茋类、生物碱、挥发油、黄酮等化合物，以茋类化合物如白藜芦醇、异丹叶大黄素及其苷类含量最高［2，3］。近年来大量的研究表明异丹叶大黄素、白藜芦醇为代表的茋类化合物有明显的抗肿瘤作用［4，5］。为了得到纯度较高的买麻藤总茋类化合物，笔者采用大孔吸附树脂技术对其进行分离纯化，报道如下。

1 仪器和试药

岛津UV－2401型紫外分光光度计;Sartorius－BP211型电子天平;791 型磁力加热搅拌器;HZ－801、HZ－806、HZ－816 型大孔树脂，上海华震科技有限公司提供;HPD－100、HPD－450、HPD－600型大孔树脂，沧州宝恩化工有限公司提供;ADS－8、ADS－5型大孔树脂，天津南开和成科技有限公司提供;白藜芦醇苷（批号111575－200502），购于中国药品生物制品检定所;买麻藤药材购于安徽省亳州市药材公司。

2 方法和结果

2.1 总茋化合物的含量测定方法

2.1.1 白藜芦醇苷标准溶液的制备

精密称取白藜芦醇苷标准品5.10 mg，用80%的乙醇溶解定容至250 mL棕色量瓶中，得到浓度为20.4 μg/mL的白藜芦醇苷标准溶液。

2.1.2 样品测定液的制备

称取买麻藤药材10 g，加入60%乙醇液60 mL回流1.5 h，滤过，滤液用60%乙醇补足至60 mL作为醇提液。精密吸取上述醇提液0.5 mL，用80%乙醇溶液稀释定容至100 mL作为样品测定液，避光冷藏待测。

2.1.3 紫外吸收光谱扫描

分别将白藜芦醇苷标准溶液和样品测定液在200～600 nm范围内做全波长扫描，得白藜芦醇苷对照液和样品液的紫外吸收光谱，样品液与白藜芦醇苷标准液在321 nm处均有吸收峰，因此可以选择白藜芦醇苷为对照溶液，测定波长为321 nm。

2.1.4 标准曲线的制备

分别精密移取白藜芦醇苷标准液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 mL置25 mL棕色量瓶中，用80%乙醇稀释定容，得浓度为 2.04、4.08、6.12、8.16、10.20、12.24、16.32 μg/mL的系列白藜芦醇苷对照液。分别在321 nm处测定其吸光度，并以浓度作为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线。得出回归方程为:A=0.045 1+0.059 6C，r=0.999 9;线性范围为2.04 ～16.32 μg/mL。

2.1.5 精密度实验

取样品测定液，连续测定吸光度6次。测定结果A=0.609±0.001，RSD=0.09%。

2.1.6 稳定性实验

取样品测定液，分别在 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时测定吸光度。测定结果A=0.614±0.04，RSD=0.50%，说明样品在3小时内稳定性良好。

2.1.7 加样回收率实验

精密吸取2.0 mL已知含量的样品测定液6份，分别加入浓度为12.24 μg/mL的白藜芦醇苷对照液2.0 mL，混匀，用80%乙醇溶液适当稀释后测定吸光度，计算回收率。结果平均回收率为（100.4±1.1）%。

2.1.8 总茋化合物的含量测定

样品测定液在321 nm波长处测定吸光度，外标法计算总茋化合物含量。

2.2 大孔吸附树脂的筛选

2.2.1 吸附母液的制备

称取买麻藤药材1 000 g，加入6倍量的60%乙醇液回流提取3次，每次1.5 h，合并回流液，减压浓缩至无醇味，冷藏放置48 h，冷藏液离心（4 000 r/min×30 min）、抽滤，蒸馏水定容至5 000 mL，作为吸附母液（每1 mL含0.2 g生药量）。经测定，母液中总茋化合物浓度为1.84 mg/mL，纯度11.9%。

2.2.2 树脂的预处理

将8种型号的大孔吸附树脂先用95%乙醇浸泡24 h，然后乙醇以2 BV/h流速通过树脂层，至流出液加水不呈白色浑浊为止，用蒸馏水冲洗树脂至无醇味，备用。

2.2.3 静态吸附实验

将预处理好的8种大孔吸附树脂1.0 g分别置具塞三角瓶中，各加入50 mL买麻藤吸附母液，室温放置12 h，每小时磁力搅拌1次，每次2 min。抽滤，并用50 mL蒸馏水冲洗含药树脂，洗液并入滤液中，测定吸附前后买麻藤浓缩液中总茋化合物浓度的变化，计算各树脂的静态比吸附量，静态比吸附量=（母液含量－残液含量）/湿树脂重量。将抽滤至干的含药树脂分别置具塞三角瓶中，各加入60%乙醇溶液50 mL，室温放置，同法搅拌，4 h后测定解吸液中总茋化合物的含量，计算解吸率，静态解吸率=解吸量/吸附量×100%。结果见表1。

表1 8种树脂对买麻藤总茋化合物的静态比吸附量和解吸率结果（n=3）

静态比吸附量结果可以看出，HPD－100，HZ－816，HPD－600吸附总茋化合物能力较强，其它型号的树脂吸附能力较差，而从解吸率来看，有5种树脂的解吸率超过了90%，洗脱比较完全，在比吸附量前3位的树脂中，仅有HPD－100解吸率超过了90%。因此综合比吸附量和解吸率结果，选择HPD－100型树脂分离纯化买麻藤总茋化合物。

2.3 HPD－100型树脂吸附工艺研究

2.3.1 正交设计

根据总茋化合物的性质和大孔树脂的吸附特性以及有关文献报道［6－7］，选取树脂柱径高比、上柱液浓度、pH 值以及流速作为考察因素，每个因素各取3个水平进行L9（34）正交实验，正交因素水平表见表2。每克湿树脂上柱量为20 mL上柱母液，吸附完成后用上柱液同体积的蒸馏水按2 BV/h流速冲洗。测定上柱母液、流出液、水洗液中总茋化合物浓度，计算动态比吸附量。动态比吸附量=（上柱量－流出液量－水洗液量）/湿树脂重量。

表2 L9（34）正交设计因素水平表

2.3.2 正交实验结果

正交结果见表3，用直观分析法比较四个因素的极差，RD＞RA＞RB＞RC，表明流速是影响结果的最主要因素。由同一因素的三个水平得知 A1＞A2＞A3，B3＞B1＞B2，C2＞C3＞C1，D1＞D2＞D3，故最佳工艺为 A1B3C2D1，即径高比 1 ∶3，浓度 0.92 mg/mL，pH 4.5、流速 1 BV/h。

表3 L9（34）正交实验结果

2.3.3 验证试验

取0.92 mg/mL的上柱液360 mL，按最佳吸附工艺A1B3C2D1进行3次重复实验。3次实验的动态比吸附量测定结果为（33.17±0.17）mg/g，均处于正交实验表较高水平，表明优选的吸附工艺合理、稳定、具有可行性。

2.3.4 泄漏曲线

称取经预处理的HPD－100型树脂9 g（径高比为1∶3，树脂床体积为15 mL），湿法装柱，上柱液浓度为0.92 mg/mL，以1 BV/h的流速过柱，每25 mL为1份，收集流出液，测定流出液中总茋化合物浓度。以收集份数为横坐标，流出液浓度为纵坐标，绘制穿透曲线，以流出液中的浓度等于上柱液浓度的10%处为泄漏点，计算饱和比吸附量。

穿透曲线见图1，可以看出在流出液在300 mL时，流出液浓度接近上柱液浓度的10%，表明树脂可吸附300 mL上柱液，树脂的饱和比吸附量为30.7 mg/g湿树脂。

图1 买麻藤总茋化合物穿透曲线

2.4 HPD－100型树脂洗脱工艺研究

2.4.1 蒸馏水洗去水溶性杂质

将买麻藤上柱液300 mL以最佳吸附工艺条件进行吸附后，用蒸馏水按2 BV/h的速度洗去含药树脂柱上的水溶性杂质，以2 BV（30 mL）为1单位，收集10份流出液，测定流出液中固含物的重量，以收集份数为横坐标，流出液中水溶性杂质重量的累积洗脱百分率为纵坐标，绘制曲线见图2。

图2 蒸馏水对水溶性杂质的洗脱曲线

从图2可以看出，随着蒸馏水用量的增加，水溶性杂质被逐步洗脱下来，当蒸馏水用量为10BV（150 mL）时，杂质累积洗脱率达到88.4%，可认为水溶性杂质基本洗脱干净。故蒸馏水用量确定为10 BV。

2.4.2 正交实验优选洗脱工艺

2.4.2.1 洗脱工艺参数的优化

根据总茋化合物的性质和大孔树脂的吸附特性，我们选择乙醇浓度、乙醇用量及洗脱速度作为考察因素，每个因素各取3个水平进行L9（34）正交实验，因素水平表见表4，测定各次试验洗脱液中总茋化合物浓度和固含率，计算比洗脱量Y1（比洗脱量=总茋洗脱量/湿树脂重量）和总茋化合物纯度Y2（总茋化合物纯度=总茋化合物含量/总固含物重×100%）。将比洗脱量和总茋化合物纯度结果进行转化评分，把比洗脱量和总茋化合物纯度最高值定为100，其余按照公式Y′1=Y1/Y1max×100，Y′2=Y2/Y2max× 100 计算相应得分，再按公式Y=0.7Y′1+0.3Y′2计算加权综合评分。再将综合评分进行统计分析，结果见表5。

2.4.2.2 结果分析

用直观分析法比较四个因素的极差，可得RA＞RB＞RD＞RC，即乙醇浓度对总茋化合物洗脱影响最大，其次是乙醇用量，洗脱速度影响最小。以空白组作为误差参照组，对其他3个因素水平进行方差分析，结果见表6。可以看出，因素A（乙醇浓度）各水平间有极显著性差异（P＜0.01），因素B（乙醇用量）、因素C（洗脱速度）各水平间没有有显著性差异（P＞0.05）。根据实验结果，因素A选择最好水平3，因素B选择最好水平3，因素C选择最好水平2，但在实验中我们发现用60%乙醇洗脱时至6 BV时，洗脱液已基本无色，考虑到洗脱液用量过大会增加成本，并给后续工艺带来困难，确定乙醇洗脱用量为6倍柱体积。因此，买麻藤总茋化合物洗脱的最佳工艺为A3B2C2，即乙醇浓度为60%，用量为6 BV，洗脱速度为2 BV/h。

表4 L9（34）正交设计洗脱工艺因素水平表

表5 洗脱工艺正交实验结果

表6 方差分析

2.4.3 验证实验

按照优化的洗脱工艺A3B2C2，同法对买麻藤吸附柱依次进行洗脱，测定各次试验洗脱液中总茋化合物浓度和固含率，计算比洗脱量和总茋化合物纯度。3次重复试验结果比洗脱量为（28.91±0.91）mg/g，纯度为（41.5±0.4）%，在正交实验表中均处于较高水平。表明优化的洗脱工艺重现性良好。

3 讨论

大孔吸附树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，现已被广泛用于天然产物的分离和富集。我们应用HPD－100型大孔树脂，在所确定的纯化工艺条件下对买麻藤醇提液进行纯化，买麻藤总茋化合物保留率为94.3%，总茋纯度提高了3.5倍。

洗脱正交实验优选的洗脱的最佳工艺结果为乙醇洗脱剂浓度为60%，洗脱液体积为6 BV，洗脱流速为2 BV/h。考虑到乙醇浓度是影响洗脱的最主要因素，而最佳水平又处于正交设计的最大值，为此，我们又以70%乙醇进行洗脱，其他因素按最优水平进行实验，结果比洗脱量与纯度结果均与60%乙醇洗脱相似，考虑到60%乙醇洗脱所需成本较低，故仍选择60%乙醇。

按照我们筛选出的工艺参数，可以将洗脱液中买麻藤总茋的纯度显著提高，但纯度仍低于50%。为了提高总茋化合物的纯度，我们尝试多种方法，如:上柱液先用壳聚糖澄清、洗脱液加入活性炭吸附，但效果都不很明显。我们通过分步洗脱研究，发现用低浓度的乙醇预洗脱除去部分杂质后，再用60%的乙醇洗脱，可以得到纯度大于65%的总茋类有效部位，但总茋化合物的保留率明显下降，该工艺是否值得应用，尚需进一步研究探讨。

［1］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草［M］.第2卷.上海:科学技术出版社，1999:358－360.

［2］冯爱芬，卢宗辉，李熙灿.买麻藤属植物的化学成分研究进展［J］. 中药材，2006，29（9）:989.

［3］丁永胜，何丽一.薄层荧光扫描法测定小叶买麻藤等植物中茋类化合物含量［J］. 药学学报，2000，35（6）:454.

［4］陈志强，吴祖泽.天然多羟基茋类化合物抗病毒及抗肿瘤活性的研究进展［J］. 中草药，2003，34（6）:附11.

［5］冯丽萍，孙庄蓉，吴祖泽.白黎芦醇及其类似物的抗肿瘤活性及机制的研究进展［J］.国外医学药学分册，2007，34（1）:21.

［6］袁桥玉，刘新桥，陈科力.虎杖中白藜芦醇苷的大孔树脂吸附工艺研究［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（5）:50.

［7］余淑娴，郑湘娟，余祖兵，等.正交实验法优选虎杖中白藜芦醇的提取工艺［J］. 时珍国医国药，2006，17（4）:594－595.