碱法提取黄精多糖及提取工艺流程的优化*1

赵瑞萌 孙庭阁 张 玲

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

泰山黄精(PolygonatumsibiricumRed)属百合科多年生草本植物，药用部分为根茎。因其独特的生长环境和气候条件在全国多种黄精中被誉为上品[1]。本实验所用的泰山黄精为楼台黄精，又名重楼黄精或鸡头黄精，为泰山正品[2]。黄精性味甘平，具有润肺滋阴、补中益气、益肾填精、抗衰老、增强人体免疫力、降血糖、降血脂及抗菌抗病毒等功效[3]。黄精在临床上主要用于治疗糖尿病、冠心病、高脂血症、白细胞减少和艾滋病等。研究表明泰山黄精主要含多糖、低聚糖、黄精皂苷、氨基酸、黄酮及微量元素等，其中黄精多糖是黄精的重要组成部分[4]。现代药理研究表明, 黄精多糖对老龄大鼠淋巴细胞百分率、红细胞、晶体核、晶体皮质超氧化物歧化酶(SOD)活性、肝脏和肾脏脂褐质含量、心脏脂质过氧化产物含量, 脑中B 型单胺氧化酶活性均有明显改善作用[5]。系统研究影响黄精多糖得率的因素，阐明其生物学活性，对开发高技术含量的黄精多糖保健品具有重要意义[6]。本实验以多糖得率为检测指标，以低浓度的氢氧化钠作为提取介质，探讨了不同碱液浓度、不同粒度及固液比对黄精多糖提取的影响，旨在为泰山黄精的质量评价和黄精多糖的开发利用及工业生产提供理论依据。

1 材 料

1.1 仪器

AB 265-S 61G/220电子分析天平(瑞士，梅特勒-托利多)； DJ-500A电子天平( 亚太公司)；旋转蒸发仪(德国BMH)；UV=755B紫外-可见分光光度计(江苏省宜兴市仪器仪表总厂)；离心机(上海安亭科学仪器厂)；BCD-215KC冰箱(青岛海尔股份有限公司)；CHN-86801奥立龙酸度计。

1.2 材料与试剂

黄精采自泰山，经泰山医学院中药教研室鉴定为泰山正品鸡头黄精。苯酚、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、蒸馏水、氯仿、正丁醇、氢氧化钠等均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 试剂的配制

2.1.1 NaOH溶液的配制 用电子分析天平精密称取1.00 g、2.00 g、3.00 g、10.00 g固体氢氧化钠，用蒸馏水充分溶解后，置容量瓶中定容至100 ml,即得1%、2%、3%、10%NaOH溶液。

2.1.2 Sevag试剂的配制 氯仿与正丁醇按1︰4比例混合即得(现用现配)。

2.1.3 苯酚溶液的配制 取适量苯酚(馏分好的),取此馏分15.00 g,用蒸馏水充分溶解后，置250 ml容量瓶中, 定容至刻度，摇匀，置于棕色瓶中,冷藏备用。

2.1.4 葡萄糖标准品溶液的配制 称取105℃干燥至恒重(前后两次质量差小于2 mg)的葡萄糖标准品0.1002 g, 置于100 ml容量瓶中, 加蒸馏水溶解并稀释至刻度, 摇匀, 取10 ml稀释到50 ml作为标准使用液备用。

2.2 标准曲线的绘制

精密量取上述配制好的葡萄糖标准溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 ml,分别置于10 ml具塞试管中，依次加蒸馏水使其总体积均达到2 ml, 然后依次加入6% 苯酚溶液1.0 ml，充分混匀, 迅速加入5.0 ml浓硫酸(加浓硫酸时, 勿沿壁加入, 应将移液管口悬于试管口, 使浓硫酸垂直入液面),混匀，放置5 min，沸水浴加热15 min，取出后冷却至室温。另以2.0 ml蒸馏水作为空白对照，所有操作均与上述相同，490 nm 下测定吸光度。以吸光度为纵坐标, 葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A =0.0136C, R2=0.9842。

2.3 稀碱法提取黄精多糖的工艺流程

鲜黄精根块洗净烘干至恒重后粉碎，分别过20、60、100目筛,加入适量不同浓度碱液过夜后,过滤，离心，滤渣加碱液过夜。然后过滤，离心，合并上清液调pH至中性，旋转蒸发浓缩后，Sevag除蛋白，活性炭脱色，浓缩，乙醇沉淀，洗涤沉淀，真空干燥黄精多糖。

2.4 换算因子的测定

准确称取已干燥至恒重的自制黄精多糖0.100 g,置于50 ml干净烧杯中，用少量蒸馏水溶解，转入100 ml容量瓶中，最后用蒸馏水定容，再准确吸取该溶液1 ml于10 ml容量瓶中，定容，混匀用作储备液。精密移取该溶液2.0 ml，按标准曲线的方法测定吸光度，计算多糖中葡萄糖的浓度，按下公式计算换算因子：F=W/(C·D)。W为多糖质量(mg)，C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/mL)，D为多糖溶液的稀释倍数。

2.5 多糖含量的测定

精密吸取黄精多糖样品溶液1 ml，按照测定葡萄糖标准溶液同样的方法测吸光度，根据标准曲线和换算因子，按下公式计算样品中多糖的百分含量：多糖含量(%)=C·D·F/W。公式中C为供试液中葡萄糖的浓度 (mg/mL)，D代表供试液中多糖溶液的稀释倍数，F为换算因子；W为供试品的质量(mg)。

2.6 正交实验设计

为了选取稀碱提取黄精多糖的最佳条件，根据预实验结果，选取药材粒度、碱液浓度、固液比3项为考察因素，各取3个水平，进行L9(33)正交实验设计，因素-水平设计见表1。每份样品5.00 g，按照上述多糖提取的工艺流程提取多糖，并测定多糖含量。

表1 稀碱法提取黄精多糖的正交实验水平表

2.7 回收率测定

精密称取黄精干粉3份，每份5.00 g，依次加入10、20、30 mg葡萄糖，按照上述筛选的最佳条件提取多糖，并按照测定标准葡萄糖溶液的方法测定多糖含量，根据公式计算加标回收率：P=(Xi-X0)/m×100%。公式中P为加入的标准物质的回收率，m为加入标准物质的量，Xi为加标样品的测定值，X0为未知样品的测定值。计算得平均回收率99%，RSD为2.15%

2.8 显色稳定性测定

取黄精多糖供试溶液, 依上述实验方法显色后, 在30、60、90、120 min测定其吸光度，结果表明，在120 min内测定，多糖溶液显色稳定，吸光度变化不大。

2.9 稀碱提取乙醇沉淀正交实验法提取黄精多糖的测定结果

提取条件对多糖得率的影响顺序为ABC，最佳提取组合是A2B3C1。见表2。

表2 正交实验结果表

从表2的直观分析可以看出，极值R反应了3个因素对多糖提取含量的影响RA>RB>RC,即提取条件对多糖收率的影响顺序为：药材粒度>碱液浓度>固液比，并得出该正交实验的最佳组合为A2B3C1，即药材粒度为60目，碱液为3%NaOH溶液，固液比为1︰15。

3 讨 论

有些多糖在碱液中有更高的提取率，本实验采用稀氢氧化钠溶液提取黄精多糖，并对获得的多糖进行初步鉴定。通过单因素实验研究原料粒度、碱液浓度和固液比对黄精多糖提取率的影响,并在此基础上进行三因素三水平正交实验,研究不同因素水平组合条件对多糖得率的影响。结果表明，药材粒度是影响黄精多糖提取率的主要因素，三个因素对黄精多糖提取率的影响顺序为药材粒度>碱液浓度>固液比,最佳的提取工艺条件为: 药材粒度为60目，碱液为3%NaOH溶液，固液比为1︰15。在此条件下黄精多糖的提取率为11.89%。

由于稀碱溶液在浸提多糖的同时，其它一些可溶性杂质也随之浸出，为了提高稀碱提取的黄精多糖的纯度，本实验利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度乙醇沉淀提纯多糖，整个实验过程简便省时，提取率高，且无需加热，可避免高温致多糖的分解，易于得到纯度高的多糖样品，是值得探索、推广的一种多糖提取分离方法。由于稀碱易使多糖发生糖苷键的断裂, 使部分多糖发生水解，故稀碱液浸提结束后要迅速将提取液pH调至中性，以免多糖发生水解。

[1] 李元富，张义涛，刘道富. 泰山药用植物[M].北京：中国医药科技出版社,1996：245.

[2] 毕研文，宫俊华，杨永恒.泰山黄精药用价值和栽培技术[J].安徽农学通报，2006，12(8)86-87.

[3] 国家药典委员会.中国药典2000年版(一部)[S].北京:化学工业出版社, 2000:252.

[4] 杨文远，郭伟，王天勇.宁夏黄精中黄精多糖的分离提取和测定[J].宁夏大学学报，1997，18 (2)：359-360.

[5] 王曙东，吴晴斋，李汉保.黄精根茎、须根中营养成分的研究[J].时珍国医研究，1995，6 (4)：15-16.

[6] 周繇.长白山区黄精属植物的种质资源开发利用[J].中国野生植物资源，2002，21(2)：34-35.