无花果叶水提物对体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制

王 涛 陶 如 翟 静 高永峰 周成军 刘金成

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.山东大学第二医院，山东 济南 250033；3.青岛大学医学院，山东 青岛 266021)

无花果,桑科榕属多年生落叶小乔木, 属于桑科无花果属植物(Ficus caricaL.)，是目前研究较多的药食兼优的植物。无花果不仅营养丰富,而且可以防治疾病。中医认为它具有消肿、解毒、消热、止痛、通乳、润肠、强身健体、延年益寿和防癌抗癌等功效[2-3]。现代医学研究发现，无花果叶抽提物(主要为补骨脂素、佛手柑内酯) 可破坏线粒体，减少细胞的能量供应,抑制核酸及蛋白质的合成,降低有关酶的活性等作用；具有抗病毒，抗菌，降低血糖、血脂,增强机体免疫功能，抑制多种肿瘤增殖等功能，这为我们研究其对增生性瘢痕组织的作用提供了理论依据[4]。

1 材料和方法

1.1主要试剂 MTT(美国Sigma公司) ; DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(美国HyClone公司)；活性胶原蛋白(四川铭让生物科技有限公司) 。

1.2取材 标本取自我校附属医院普外科，瘢痕疙瘩患者手术切取的瘢痕组织。取材部位：前胸，年龄15～32岁，瘢痕生长时间1～4年，所有患者均无其它器质性疾病，未做过特殊治疗及激素治疗，均经过临床和病理诊断证实。

1.3无花果叶水提物的获得 无花果叶研磨成粉 ,水浸泡过夜后 ,用文火浓缩成含生药的水煎剂，用 0.45 μm孔径的滤膜除去杂质和微生物。用含 10%小牛血清的 DMEM培养液稀释，配成不同浓度无花果叶的复方制剂。

1.4细胞培养 在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5～1 mm3的小块，加入少量小牛血清，接种于培养瓶中，在95%空气,5%CO2, 37°C, 饱和湿度条件下培养24小时，使组织块牢固贴附于瓶壁。 然后加入适量含20%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，每周两次换液。约3～4周，原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1︰2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次，待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3～10代细胞。

1.5成纤维细胞形态变化 取对数生长期的成纤维细胞接种于2.5 cm培养皿培养，待细胞贴壁后，用1 mg/L无花果叶水提物处理细胞，对照组不处理；于加药12 h、24 h、48 h后，倒置相差显微镜观察细胞形态和凋亡情况并照相。

1.6MTT法检测成纤维细胞抑制率 纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞悬液,调整浓度为5×105/ml接种于96孔板内, 0. 2 ml/孔。每个样本设4个复孔。置培养箱内孵育,待细胞完全贴壁后更换为含无花果叶提取物的培养液(无花果叶提取物溶解于DMSO液中,贮存浓度为5 mg/ml)终浓度分别为0.1 mg/L, 0.5 mg/L, 1.0 mg/L, 1.5 mg/L，另设不加无花果叶水提物和最高浓度DMSO液(20 μg/ml)的培养液做空白对照组。置培养箱中分别孵育24 h、48 h、72 h后,每孔加入20 μlMTT(5 mg/ml)继续孵育4 h,之后每孔加入100 μl，20% SDS有机溶剂,孵育20 h。用酶标仪检测570 nm吸光度,计算细胞活性率,统计。

1.7瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原测定( 氯胺 T 法) 配制标准羟脯氨酸应用液、柠檬酸缓冲液、0.05 mol/L 氯胺 T 溶液、3.15 mol/L 过氯酸溶液、10%的对二甲氨基苯甲醛溶液。消化单层培养细胞, 以 2×105/ml 接种于 25 cm2的培养瓶, 待细胞贴壁后设空白对照组与实验组。空白对照组换液, 而实验组则弃去原培养液, 用1 mg/L无花果叶水提物处理细胞, 观察 12 h、24 h、48 h、72 h。每个时间段分别收集细胞, 经处理后上机检测。以羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量为测量对象, 间接推算胶原含量。取上清液 0. 5 ml, 经一系列反应后在紫外分光光度计下, 560 nm 比色测量。计算公式如下:样品 Hyp 浓度(μg/ml)

1.8统计学处理 所有实验数据计算均数和标准差,细胞增殖实验资料用方差分析处理,其他实验数据用卡方检验处理,P≤0.05认为差异有显著性。

2 结 果

2.1成纤维细胞形态学变化 取l mg/L无花果叶水提物，各取l ml加入细胞培养瓶中，于24 h、48 h、72 h观察，与对照组相比较，倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态变化，实验组成纤维细胞数目减少，体积变小，与邻近细胞接触减少，突起变短变少，细胞皱缩(图1 B, C, D)，对照组细胞形态正常，胞体呈梭形，细胞核大小及染色均匀，胞浆丰富，细胞间有突起相连，折光性强(图1A)。

图1 成纤维细胞形态变化对照组：生理盐水；A组：无花果叶水提物作用24 h；B组：无花果叶水提物作用48 h；C组：无花果叶水提物作用72 h

2.2MTT法检测细胞增殖 将实验用成纤维细胞以1.0×105/ml密度接种于96孔培养板中，每孔100 pl，37℃、5%C02孵箱中培养至细胞贴壁，加入无花果，使其终浓度为分别为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，重复10孔。分别于37℃、5%C02孵箱中培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT(smg/ml)20 pl，继续培养4 h。吸弃培养基，加入MTT裂解液100 pl，37℃、5%C02孵箱中孵育18 h。紫色结晶完全溶解后，酶标仪单波570 nm检测各组细胞的OD值，并以0 mg/L组为对照，其余各组按:抑制率=(对照组吸光值-各浓度组吸光值)/对照组吸光值×100%与之比较。经5次以上实验观察不同时段的无花果对细胞增殖是否有抑制或促进作用。结果显示，无花果对成纤维细胞增殖有明显抑制作用，无花果对成纤维细胞抑制作用随作用时间增加而增强，各组间相比有统计学差别(P≤0.05)，如表1。

2.3胶原蛋白含量的测定 空白对照组中，Hyp含量无明显变化；而FLE各组中，不同时间段的Hyp 含量随时间的延长而增加，有显著性差异(P<0.05) 。说明无花果提取物实验组能降低瘢痕成纤维细胞中Hyp的含量，如表2。

表1 无花果叶水提物对成纤维细胞增殖的抑制作用(n=10,% )

表2 无花果叶水提物对成纤维细胞的胶原蛋白合成的影响(n=3,% )

3 讨 论

瘢痕疙瘩(keloid)是一种以胶原纤维等细胞基质过度产生和沉积为特征的皮肤纤维化疾病，在皮肤修复过程中成纤维细胞持续活化所产生的细胞外基质(ECM)成分,如纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖,尤其是胶原蛋白的过度堆积,从而导致真皮的持久纤维化[1]，当今尚无可靠的特异性治疗方法,单纯手术切除复发率极高。目前越来越多的学者倾向于认为瘢痕疙瘩是一种良性的皮肤肿瘤。

成纤维细胞是创伤修复的主体细胞，是构成早期肉芽组织的主要成分。其功能主要是合成胶原及分泌一些细胞因子参与创伤修复的调控。成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制是形成瘢痕的生物学基础，有学者比较了人增生性瘢痕不同时期的细胞总数与凋亡细胞数，发现增生性瘢痕组织中确实存在凋亡细胞，这些凋亡细胞主要是成纤维细胞和血管内皮细胞，成熟期瘢痕的凋亡细胞数显著多于增生期，并与成纤维细胞总数的减少呈负相关[5]。

本实验应用不同浓度无花果叶提取物干预体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞,结果观察到无花果叶提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖具有明显抑制作用, 同时可抑制胶原蛋白的合成，从而抑制组织的纤维化。本研究的结果表明，无花果叶提取物具有抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，抑制胶原蛋白增殖的作用，但其具体机制如何，尚需进一步研究。

[1] 陈晓栋,张国成.促纤维化细胞因子与瘢痕疙瘩[J].国外医学:皮肤性病学分册, 2002, 28(1): 31-34.

[2] Yin WP,Chen HM,Wang TX,et al.Anew coumarin compound with anticancer activity[J].Chin Tradit Herb Drugs,1997,28(3):3-4.

[3] Mao XW,Chen YD,Yang L,et al.Study on main composition extraction separation of Fig andapplication[J].J Chem Indus Forest Prod,1998,6:22-25.

[4] Mao XW,Chen YD,Yang L,et al.The anticancer research overview of the Fig[J].J Chem IndusFor Prod,1998,5:13-15.

[5] 汪琴，吴宗耀. 肌成纤维细胞凋亡与增生性瘢痕消退的关系[J].第三军医大学学报，1999，21(4)：190-192.