反相高效液相色谱法测定浓缩苹果汁中的10种酚类物质*

孔祥虹 何 强 郝少莉

(1.陕西师范大学，西安 710062; 2.陕西出入境检验检疫局，西安 710068； 3. 陕西省农业工程勘察设计院，西安 710068)

苹果多酚是苹果中所含多元酚类物质的通称，是果实在生长发育期间的次生代谢产物。苹果多酚与新鲜苹果及其加工制品(如苹果汁、苹果酒等)的色泽、风味及稳定性密切相关[1,2]。苹果多酚是苹果中具有重要生理和药理作用的主要成分之一, 苹果多酚具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血压、预防心血管疾病、抗突变、抗辐射、抗癌防癌、抑菌、防龋之功效[3,4]。

近年来，有关苹果及苹果汁中多酚的检测有不少报道，吴燕华等[5]采用高效液相色谱法测定了苹果中10种多酚，但未给出检出限，无法了解该方法的灵敏度。其它报道也多采用反相高效液相色谱法[6-9]，但检测的多酚种类未超过9种，而同时分离浓缩苹果汁中10种酚类物质检测方法未见文献报道。

笔者建立了反相高效液相色谱同时测定浓缩苹果汁中10种多酚的方法，该法具有简便、准确、可靠的特点，可为浓缩苹果汁的营养价值评价及打击果汁掺假[10]提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1100型，配有Agilent 1100VWD可变波长检测器，美国Agilent公司；

反式肉桂酸、根皮素、二羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、邻香豆酸、阿魏酸、槲皮素、异槲皮素：均购于美国Sigma公司；

甲醇、乙腈：色谱纯；

乙酸(0.45 μm膜过滤)、乙酸乙酯：分析纯；

浓缩苹果汁：陕西海升果业发展股份有限公司渭南分公司；

反式肉桂酸、对香豆酸、二羟基苯甲酸、邻香豆酸、槲皮素标准溶液：浓度均为1.0 mg/mL，分别精确称取反式肉桂酸、对香豆酸、二羟基苯甲酸、邻香豆酸、槲皮素标准品0.0250 g，用甲醇定容至25 mL；

根皮素、咖啡酸、阿魏酸标准溶液：浓度均为1.0 mg/mL，分别称取根皮素、咖啡酸、阿魏酸0.0100 g，用甲醇定容至10 mL；

绿原酸标准溶液：10 mg/mL，称取绿原酸0.050 0 g，用甲醇定容至5 mL；

异槲皮素标准溶液：0.5 mg/mL，称取异槲皮素0.002 5 g，用甲醇定容至5 mL；

10种标准品混合溶液：分别移取二羟基苯甲酸、对香豆酸200 μL，绿原酸1.50 mL，咖啡酸700 μL，反式肉桂酸、阿魏酸、邻香豆酸、根皮素、槲皮素、异槲皮素100 μL于10 mL容量瓶中混合并用甲醇定容。

1.2 样品溶液制备

准确称取果汁10.00 g，加水约10 mL(以溶解其中的高糖利于多酚的萃取)，摇匀，加入30 mL乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，于40℃旋转蒸发至近干，用甲醇定容至2.00 mL。用0.45 μm微孔滤膜过滤后进色谱柱。

1.3 色谱条件

色谱柱：Insertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)美国Agilent公司；10种单酚的色谱条件为流动相C：乙腈-0.5%乙酸(体积比1∶1)；流动相D：2%乙酸，梯度条件：0～55 min, C从10%升为55%，相应D由90%降为45%；55～60 min， C从55%升为100%，相应D由45%降为0%；60～65 min， C从100%降为30%，相应D由0%升为70%；流速：0.8 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：35℃；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

2.1 最佳检测波长的选择

通过分析各单酚在紫外区域吸收情况得知，该8种单酚在280 nm下均有较大吸收，所以最终确定本实验检测波长为280 nm。

2.2 流动相及其流速的选择

经查阅资料及实验总结，实验采用乙腈-0.5%乙酸水溶液(体积比为1∶1)和2%乙酸水溶液为流动相。由于所测多酚种类较多，极性有差异，流动相仅采用一种比例无法将所有多酚达到较好分离，故采用梯度洗脱。最终确定洗脱程序为：0～55 min，乙腈-0.5%乙酸用量(体积分数)从10%升为55%，相应2%乙酸体积用量由90%降为45%；55～60 min，乙腈-0.5%乙酸用量从55%升为100%，相应2%乙酸由45%降为0%；60～65 min，乙腈-0.5%乙酸从100%降为30%，相应2%乙酸由0升为70%。

对流动相流速进行试验，得知流速过高，分离效果较差，但流速过低又会延长分析时间。综合考虑确定流动相流速为0.8 mL/min。

2.3 柱温的选择

设定柱温为25、35、40℃，分别进样进行试验，结果显示，随着柱温升高分离度变大，分析时间缩短，但是柱温太高会损坏色谱柱，当温度为35℃时分离度已完全达到要求，因此最终确定柱温为35℃。

2.4 定性分析

将10种单酚混合标准溶液在1.3色谱条件下进样分析，色谱如图1所示。由图1可知，二羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异槲皮素、邻香豆酸、反式肉桂酸、槲皮素、根皮素保留时间分别为：12.970、22.171、25.351、35.252、39.045、42.500、47.320、61.893、62.232、63.791 min。

图1 10种单酚混合标准溶液色谱图

2.5 标准曲线和检出限

利用混合标准溶液经稀释配制成系列浓度的混合标准工作溶液，在已确定的色谱条件下进样分析，然后根据色谱峰面积和标准物质的含量关系进行线性回归。

将一定浓度的标准溶液逐级稀释，依次进样10 μL，当信噪比等于3时所对应的标准溶液浓度为检出限。

各组分的线性相关系数、线性范围和检出限列于表1。由表1可知，相关系数均大于0.999 3，表明线性关系良好，满足定量分析的要求。

表1 各酚标准曲线及检出限

注：x—标准物质的含量，mg/L；y—标准物对应的峰面积。

2.6 回收试验和精密度试验

在浓缩苹果汁样品中分别加入混标溶液1.0 mL，按照1.2方法进行处理,在1.3色谱条件下进样分析。根据实际测定值计算回收率，重复5次进样进行精密度试验，试验结果见表2。

表2 各酚的回收率和精密度试验结果(n=5)

2.7 样品测定

将样品的HPLC图谱与图1比较对其进行定性分析，样品中各酚类物质的含量以峰面积查相应的标准曲线求得，结果列于表3。

表3 浓缩苹果汁中各酚含量 mg/kg

由表3可以看出，浓缩苹果汁中主要多酚物质为二羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异槲皮素、邻香豆酸、槲皮素，且酸性酚含量高于中性酚，绿原酸含量最高。

3 结论

(1)采用乙腈溶液和乙酸溶液为流动相，选择适宜的检测波长，通过调节流速、柱温等参数，可以较好地实现浓缩苹果汁中主要多酚物质的分离，各酚的标准曲线具有较好的线性，能够用于定量分析。建立的方法具有较高的灵敏度和精密度，各酚的回收率均在85%以上，说明该方法准确可靠。

(2)浓缩苹果汁中主要的多酚物质为二羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、异槲皮素、邻香豆酸、槲皮素，实验结果可为浓缩苹果汁的营养价值评价及功能成分研究提供参考。

[1] Schobinger U,Barbic I,Duerr P,et al.Phenolic compounds in apple juice-positie and negative effects[J].Fruit Processing,1995,5(6):171-172.

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