烟叶中制备高纯度茄尼醇的新工艺

王艳，史益强，戴琳，于颖

(中国药科大学，江苏南京210009)

大量的研究结果表明，茄尼醇具有较强的抗癌生物活性，是合成心血管疾病、抗癌、抗溃疡等药物的中间体，可作为合成辅酶Q10［1］和维生素K2的侧链，合成二元酸茄尼醇乙酰葡萄糖二酯［2］等抗溃疡药物、抗癌药物的原料。在医学上广泛用于治疗充血性心脏病所致浮肿、肺充血、心绞痛，治疗急慢性肝炎、亚急性肝坏死，治疗坏血病、十二指肠溃疡、胃溃疡、坏死性牙周炎等。

烟叶中提取的茄尼醇含量和纯度均较低，必须经特种设备加工处理后去除杂质，并将纯度提高至90%以上才能作为合成辅酶Q10或维生素K2等药物的原料。

因此本试验主要探讨了高纯度茄尼醇的制备工艺，目前一般采用有机溶剂萃取、多次重结晶的提纯方法，产品中茄尼醇的含量一般只能达到60%～70%［3］，生产成本也很高。本实验以烟叶为原料，采用混合溶剂萃取得烟叶浸膏，乙醇溶液稀释皂化反应物，以石油醚萃取茄尼醇，再以乙醇溶解脱蜡、结晶初步精制，最后经大孔树脂吸附纯化得到高纯度茄尼醇。改进的制备工艺，可以提高效率，节约能源。

1 主要原料、试剂和仪器设备

原料:烟叶(产地:辽宁;等级:中等)。

试剂:石油醚(CP);无水乙醇、甲醇(AR);乙醇、甲醇(SP);茄尼醇对照品(上海融禾医药科技发展有限公司，98%);大孔树脂(型号:YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802)。

实验设备:玻璃仪器;提取设备;旋转蒸发仪;真空干燥箱;高速离心机;植物粉碎机。

检测仪器:高效液相色谱仪。

2 方法与结果分析

2.1 检测方法

HPLC测定:色谱柱为ODS(250 mm×4.6 mm);柱温为25℃;流动相为甲醇-乙醇(25∶75，V/V);检测波长:210 nm;流速为1 mL/min。

2.2 初提和皂化工艺

将烟叶去梗后在60℃的烘箱中干燥4 h，粉碎成颗粒状。称取预处理的烟叶25 g装入500 mL的三口瓶中，加入一定体积混合溶剂，在50℃下加热3 h，冷却后抽滤，滤液蒸干回收溶剂，得粗品茄尼醇浸膏。

皂化过程如下:将得到的粗品茄尼醇浸膏，加入一定体积的0.15 mol/L氢氧化钠的乙醇溶液，在50℃下加热2 h，冷却，用稀盐酸调pH值约为6～7，等体积石油醚萃取3次，将萃取液蒸干回收溶剂，得茄尼醇浸膏。

本实验采用混合溶剂乙醇-石油醚对烟叶中的茄尼醇进行提取，并将得到的茄尼醇浸膏溶解，对其进行了皂化反应。对混合溶剂体积比以及料液比进行了考察，数据见表1、2所示。

表1 混合溶剂体积比对茄尼醇提取的影响

从表1可知，随着乙醇体积含量的增加，茄尼醇得率也逐渐增加，而乙醇为提取液进行提取时，其提取量反而减少了，其原因可能是乙醇是极性溶剂，对植物细胞有极强的穿透作用，使得植物中的成分易于溶出而被提取出来，导致混合溶剂条件下茄尼醇的提取量更高，而茄尼醇易溶于非极性溶剂，使得提取出的部分茄尼醇溶解在石油醚相，而此时乙醇相中茄尼醇的量减少，有利于乙醇进一步对植物中的物质进行提取，达到动态提取的目的。

表2 料液比对茄尼醇提取的影响

从表2可以看出，当料液比为1∶12(g∶mL)时，茄尼醇得率可达到1.24%，料液比增大，茄尼醇成分的提取量变化并不大，反而有减少的趋势。可能的原因是随着料液比的增大，混合溶剂中乙醇的体积过大，相对的石油醚体积较少，不利于从乙醇相中萃取茄尼醇，即不能减少乙醇相中的茄尼醇，因此达不到动态提取的目的。

从表1、2中数据可知，皂化是茄尼醇提取过程所必需的关键步骤，茄尼醇通常以游离态和化合态两种形式存在，其中游离态占主要成分，化合态一般以脂肪酸脂的形式存在。皂化反应能使化合态的茄尼醇释放出来，提高茄尼醇的得率，并有助于提高茄尼醇的纯度。混合溶剂采用乙醇和石油醚较好，安全且价格合理;乙醇和石油醚体积比为4∶1，料液比(g∶mL)=1∶12时，茄尼醇的提取量最多，粗品纯度也较高。

2.3 结晶

将皂化后所得的茄尼醇浸膏加入适量溶剂中溶解，用高速离心机离心，除去不溶性杂质，将得到的溶液放置于－18℃环境中过夜，抽滤，得到的黄色颗粒状茄尼醇粗品。实验对溶剂、温度及时间等做了初步考察，数据见表3、4所示。

表3 不同体积的试剂对茄尼醇溶解性比较

表4 结晶条件的选择

显然选择乙醇、乙酸乙酯作为茄尼醇的结晶试剂是比较理想的。但实验中发现乙酸乙酯对皂化后浸膏溶解较差，而乙醇对其溶解性较好，并且在最底层的不溶物，经检测为杂质，经过滤除去，所以选择乙醇为茄尼醇的结晶试剂。

从表4的结果可知，茄尼醇在－18℃、6 h(过夜)的条件下结晶效果较好，结晶茄尼醇收率较好，含量较高。其他条件下结晶不好的原因可能是温度较高，茄尼醇析出较少，结晶物质与杂质分离不好，因此选择18℃、6 h(过夜)作为茄尼醇的最佳结晶条件，可获得纯度为63.4%的茄尼醇。

2.4 大孔树脂纯化

(1)大孔树脂的前处理与再生［4，5］:取YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802几种树脂，经乙醇、3%盐酸、水、5%氢氧化钠依次再生处理后，水洗至pH中性。(2)样品溶液制备:取结晶后茄尼醇粗品1.2 g，溶于2 mL无水乙醇，备用。(3)大孔树脂型号确定:精确量取10 mL上述经预处理过的大孔树脂装柱(30 mm×1.5 mm)，平行两根，共分两次完成该实验。分别精密吸取茄尼醇样品液0.4 mL上柱，收集10 mL/份，流速5 mL/h。依次用40%、60%、80%乙醇与无水乙醇各80 mL梯度洗脱，将收集的洗脱液经HPLC在线检测，将纯度大于90%部分合并。(4)大孔树脂最佳层析容量确定:精确量取10 mL选定的上述经预处理过的大孔树脂装柱(30 mm×1.5 mm)，平行3根。分别精密吸取茄尼醇样品液0.2、0.4与0.6 mL上柱，收集10 mL/份，流速5 mL/h。依次用40%、60%、80%乙醇与无水乙醇各80 mL梯度洗脱，将收集的洗脱液经HPLC在线检测，将纯度大于90%部分合并，减压蒸馏除去乙醇浓缩得到高纯度茄尼醇，确定最佳层析容量。

在进行大孔树脂纯化的过程中，上样的茄尼醇粗品纯度达到60%以上，这大大减少了大孔树脂吸附纯化的时间，同时也提高了所得茄尼醇的纯度。

大孔吸附树脂的极性与空间结构(孔径和比表面积)对吸附作用的影响较大［6，7］，在树脂型号的选择时，选用了几种常见且性质相似的大孔吸附树脂YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802，具体的物理结构参数见表5。

4种大孔吸附树脂都对茄尼醇有明显的吸附作用，除去了一些有极性的杂质。相同树脂条件下，无论是不同指标成分之间，还是不同浓度的乙醇洗脱液之间，解吸率数值显得无规律可循。不同大孔吸附树脂解吸附作用总体上看，D-1300、HZ-816、HZ-802这3种树脂纯化的茄尼醇纯度可达到91%，而通过YPR-Ⅱ树脂纯化的茄尼醇纯度达到93.6%以上，优于上述3种树脂。因此，在大孔树脂最佳层析容量确定时，我们选用了YPR-Ⅱ进行考察，数据见表6所示。

表5 吸附树脂型号及物理结构参数

表6 大孔树脂最佳层析容量

从表6可知，大孔吸附树脂YPR-Ⅱ的最佳层析容量是15.1 mg/mL。

表7结果表明，90%茄尼醇主要集中在无水乙醇洗脱液中，占全部洗脱液中总茄尼醇的88.1%，故确定洗脱条件为:用蒸馏水、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇洗去极性杂质，再用无水乙醇洗脱，收集无水乙醇洗脱部分，HPLC检测含量为93.6%。

表7 不同洗脱液中茄尼醇的含量及收率

3 结论

3.1 在茄尼醇初提的过程中，采用石油醚-乙醇混合溶剂作为提取剂，体积比为1∶4，料液(g∶mL)比为1∶12时，为最佳提取条件，不仅提高了茄尼醇的得率，而且提高了茄尼醇浸膏的纯度。

3.2 皂化反应能使化合态的茄尼醇释放出来，提高茄尼醇的得率，并有助于提高茄尼醇的纯度。皂化后的茄尼醇的量比皂化前茄尼醇的量增加了约20%左右。

3.3 结晶时，结晶容积选择乙醇，结晶条件在－18℃、6 h(过夜)时结晶效果较好，结晶茄尼醇收率较好，含量较高。

3.4 纯化时，本实验采用了YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802几种常用大孔树脂作为分离介质，均可将含量为63%左右的茄尼醇粗品纯化成含量高达93.6%以上的茄尼醇，说明YPR-Ⅱ、D-1300、HZ-816、HZ-802这几种大孔树脂用来分离纯化茄尼醇是可行的。大孔树脂具有吸附容量大、解吸条件温和、选择性好、可重复使用等优点，本实验采用的分离纯化茄尼醇的工艺路线、设备投资少、收率稳定，具有良好的应用前景。

［1］West D D.US:20020156302［P］，2002-10-24.

［2］王超杰，宋金勇，赵瑾.二元酸茄呢醇乙酰葡萄糖二酯的合成及其生物活性［J］.应用化学，2003，0(8):754-759.

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