多指标优选醒目颗粒水提醇沉制备工艺

玄律，倪健

(1.北京市海淀区北太平庄医院药剂科，北京100082;2.北京中医药大学中药制药系，北京100102)

视网膜病变是糖尿病严重并发症之一，其病变表现为微血管瘤形成、出血、水肿、渗出等眼底的改变，导致视网膜水肿，黄斑囊样水肿，视网膜出血，以及毛细血管闭塞和新生血管形成。醒目颗粒中含有枸杞子、丹参、石斛、三七、牡丹皮等药材，诸药合用，共凑清热利湿，滋补肝肾，活血明目之功效，适用于糖尿病视网膜病变湿热内蕴，肝肾阴虚，瘀血阻滞证。

因本处方中药味较多，有效成分较复杂，为最大限度的提取药物有效成分，充分发挥中药复方的功效，故在提取工艺上分别采用水蒸气蒸馏法提取挥发性成分、乙醇回流提取和水煎煮提取，水提液浓缩后，加乙醇沉淀，最后制粒。本文旨在通过多指标控制优选醒目颗粒水提醇沉的最佳工艺。

1 仪器与试药

药材(市售)经北京中医药大学刘春生教授鉴定符合2005版中国药典项下规定;甜菜碱对照品(110894200503)和丹酚酸B对照品(111562-200807)均购于中国药品生物制品检定所;色谱柱:Diamonsil C18(5 μm 250 mm×4.6 mm);岛津SPD-10Av高效液相色谱仪。双波长薄层扫描仪(cs-9000 SHIMADZU)，甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

2 制备工艺考察

2.1 水提工艺优选

2.1.1正交试验设计处方中药材有效成分多为水溶性，为提高提取效率，采用诸药合并水煎煮提取法。通过预试验研究和参考相关文献［1-4］，以加水倍量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)3个因素作为考察对象，以甜菜碱和丹酚酸B提取率综合指标作为评价指标，采用L9(3)4表进行正交试验。因素水平安排见表1。

表1 因素水平表

2.1.2 试验方法及数据按处方比例称取枸杞子、丹参等药材9份，按上述因素水平表采用L9(3)4正交表进行水煎煮提取，提取液滤过、浓缩，干燥，得干浸膏，分别测定其中甜菜碱和丹酚酸B提取率。试验结果见表2，方差分析见表3。

由表2、表3可见，各因素均无显著影响，对药材有效成分提取率的影响程度依次为加水倍量(A)>提取次数(C)>提取时间(B)，直观分析水提最佳工艺为A2B2C2，即10倍量水，煎煮2次，每次1.5 h。

2.1.3 水提工艺验证试验按处方比例取药材2份，按最佳工艺条件提取，测定甜菜碱和丹酚酸B提取率。实验结果见表4。结果表明该工艺稳定，甜菜碱及丹酚酸B的提取率较高。

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

表4 水提工艺验证实验结果

2.2 醇沉工艺优选

醇沉工艺主要受到提取液相对密度和醇浓度的影响，故本试验把两者作为考察因素。分别按处方比例称取药材3份，按水提最佳工艺进行提取，提取液分别浓缩至相对密度1.00～1.05、1.05～1.10、1.10～1.15(60℃)，再将各相对密度下的提取浓缩液各分3份，每份分别加乙醇至含醇量达50%、60%和70%，静置24 h，回收乙醇，浓缩，干燥，得干膏粉，测定其甜菜碱和丹酚酸B转移率。实验结果见表5。

由表5可以看出，当药材提取液浓缩至相对密度1.05～1.10，加乙醇至含醇量达50%时，综合指标最高，且甜菜

碱及丹酚酸B转移率均较高，所以确定醇沉最佳工艺为:药材提取液浓缩至相对密度1.05～1.10(60℃)，加乙醇至含醇量达50%。

表5 醇沉工艺实验结果

3 含量测定

3.1 甜菜碱含量测定

3.1.1 薄层色谱条件同中国药典一部，枸杞子［含量测定］项下操作。

3.1.2 供试品溶液的制备同中国药典一部，枸杞子［含量测定］项下操作。

3.1.3 药材供试品溶液的制备同3.1.2项下操作。

3.1.4 标准曲线的绘制分别精密吸取上述对照品溶液2、3、4、5、6 μL点于同一硅胶G薄层板上，按3.1.1项下操作，以点样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=925.91X+9 022.3，r=0.996 1。结果甜菜碱在8.06～24.18 μg范围内线性关系良好。

3.1.5 药材中甜菜碱的含量测定分别精密吸取对照品溶液1 μL和4 μL，药材供试品溶液3 μL，其余同3.1.3项下操作。以线性回归两点法计算，得本批枸杞子药材中甜菜碱的含量为0.64%。

3.1.6 供试品溶液中甜菜碱含量测定分别精密吸取对照品溶液1 μL和4 μL，供试品溶液4 μL交叉点于同一硅胶G薄层板上，其余操作同3.1.3项下操作。以线性回归两点法计算。

3.2 丹酚酸B的含量测定

3.2.1 高效液相色谱条件色谱柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:(甲醇-乙腈)-(甲酸-水)=(30∶15)∶(1∶59)=43∶57;检测波长为286 nm;流速1 mL/min。此条件下，峰形较好。

3.2.2 对照品溶液的配制精密称定丹酚酸B对照品2.8 mg，置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度;精密吸取该对照品溶液5 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

3.2.3 供试品溶液的制备精密称取干膏粉适量(约相当于丹参生药材0.2 g)，余同中国药典一部，丹参［含量测定］项下操作。

3.2.4 药材供试品溶液的配制精密称取丹参药材粉末(过三号筛)0.207 4 g，其余同中国药典一部，丹参［含量测定］项下操作。

3.2.5 标准曲线的绘制分别精密吸取上述丹酚酸B对照品溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色谱仪中测定，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y=921 060X－8 241.1，r=0.999 6。结果丹酚酸B在0.28～1.4 μg范围内线性关系良好。

3.2.6 药材供试品中丹酚酸B含量测定精密吸取药材供试品溶液8 μL注入高效液相色谱仪中，按3.2.1项下条件操作，按回归方程计算。测得本批丹参药材中丹酚酸B含量为3.46%。

3.2.7 供试品中丹酚酸B含量测定精密吸取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪中，按3.2.1项下条件操作。按回归方程计算。

4 讨论

4.1 处方中药味较多，各味药中所含有效成分的理化性质不同，单纯采用一个指标不易于控制制剂质量，由于枸杞子为君药，丹参中有效成分丹酚酸B不稳定易分解，故以甜菜碱和丹酚酸B为考察指标，进一步保证了复方制剂的质量，优选出更为合理的水提醇沉工艺。

4.2 在水提工艺中，如果将两者的权重改为甜菜碱-丹酚酸B=0.7∶0.3，则统计学上有差异。虽然枸杞子为方中君药，丹参为方中佐药，但是两者在方中的用量是相等的，所以将两者的权重定为甜菜碱-丹酚酸B=0.5∶0.5更能反应原方的用药目的，更合理。

4.3 在水提工艺中，无论是分别以甜菜碱和丹酚酸B为指标，还是以两者为指标在统计学上均没有差异。考虑可能是由于所选因素水平范围较窄，将提取时间缩短到0.5 h，延长至2.5 h，或是将加水倍量分别增加至14倍量或减少至6倍量，经分析则有统计学差异。但是，本文所选择的因素水平为工业生产常用，单纯为获得统计学差异而做的因素水平的调整，在工业大生产中并不可行。故虽本文所选因素水平未能做出统计学差异，但对工业实际生产同样具有指导意义。

4.4 本文仅对醒目颗粒水提醇沉工艺进行优选，其余醇提和水蒸气蒸馏提取部分有待于进一步研究。

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