汉族儿童细胞色素P450单核苷酸多态性及其代谢表型分布的研究

肖 婧 顾 艺 孙 琳 苗 青 焦伟伟 冯卫星 吴喜蓉 郭雅洁 申阿东

细胞色素P450(CYP450)是人体内最重要的药物Ⅰ相代谢酶，主要分布在肝脏，在肠道、肺、肾和脑等组织中也有少量分布，该酶可促进氧化、羟化、脱烷基和脱氨基等反应的发生[1,2]。人类CYP450目前已发现了18个家族、44个亚家族[3～5]，其中CYP1、CYP2和CYP3家族占肝脏CYP450总量的80%以上，参与目前市场上90%以上药物的代谢[6～8]，同时还对毒物、致癌物的活化与解毒有着重要作用。

20%～95%药物疗效和不良反应的个体差异由遗传变异所决定[4]。遗传变异决定了药物代谢酶在不同个体中含量和活性的差异，从而导致不同个体对药物反应的不同。单核苷酸多态性(SNPs)是决定个体间差异最主要的多态形式。可依据CYP450不同亚型的SNPs将人群划分为不同的代谢表型[9]。CYP450亚型中某些位点的多态性可引起相应酶活性的升高、降低甚至失活。其中，位于启动子区的CYP2E1 -1053C>T突变可使下游基因的转录和表达水平提高10倍以上[10]；位于外显子区的CYP3A4 878T>C突变可引起氨基酸改变，使CYP3A4酶活性呈轻至中度增强[11,12]；位于外显子区的CYP2D6 100C>T和CYP2C9 1075A>C突变可引起氨基酸改变，使相应酶活性明显下降[13,14]；位于内含子区的CYP2E1 7632T>A突变引起酶活性降低的原因尚不明确[10]；而位于外显子区的CYP2C19 636G>A、681G>A/C和位于内含子区的CYP3A5 6986A>G突变则分别导致终止密码和异常剪切，从而使翻译提前终止或产生无功能的截短蛋白[12,13]。

目前，中国汉族人群CYP450基因型和代谢表型的研究已有报道，为进一步了解CYP450亚型重要SNPs及其代谢表型在中国汉族人群的分布，丰富和完善中国汉族人群相关遗传学数据库，本研究通过实时PCR基因分型法，对中国汉族分析人群CYP450 6个亚型的8个SNPs位点进行检测，为今后从分子水平进行个体化用药提供依据。

1 方法

1.1 样本来源和选择 选择2005年3月至2008年12月首都医科大学附属北京儿童医院门诊及病房收治的汉族患儿，并除外患有严重感染性疾病、自身免疫性疾病、内分泌系统疾病、遗传性疾病及先天性疾病患儿。以进行血生化的检测剩余血样量能保证本研究血样需要量的1 200份作为研究样本，使用随机数字表法从中随机选取其中的300份进行CYP450基因型检测。

1.2 伦理审核 本研究经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会审核通过。300份进行CYP450基因型检测患儿不谋求其社会人口学和病史资料

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA抽提 取EDTA抗凝静脉血2 mL，采用改进的Miller盐析法抽提全血中人基因组DNA，溶于TE溶液，经分光光度计测定浓度后，于-20℃保存。

1.3.2 SNPs位点的选择 SNPs的选择依据主要基于2点：①可引起CYP450含量或活性改变的SNPs；②在HapMap(The International HapMap Project，国际人类基因组单体型图计划)数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)中，中国汉族人群的次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>2%的SNPs。基于此，本研究共选取CYP450 6个亚型(CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5)的8个SNPs位点进行突变检测，基本信息见表1。

表1 CYP450 6个亚型的8个SNPs位点的基本信息

Notes 1) The major allele names were accordant with Human Cytochrome P450 Allele Nomenclature Committee (http://www.cypalleles.ki.se/index.htm); 2) Rs was NCBI dbSNP

1.3.3 PCR扩增 CYP450亚型SNPs位点检测的引物及探针的序列(ABI公司合成)见表2，目的片段扩增使用TaqMan SNPs genotyping Assays在MJ Opticon-2(CYP2E1的2个位点)和Stratagene-Mx3005P荧光定量检测仪(其余的6个位点)上进行PCR扩增。扩增条件为：95℃ 10 min；92℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。每个循环结束时测定每孔的A值，扩增循环结束后，根据定量PCR仪分析软件获得的荧光曲线及Ct值来判定样品的SNP类型，并用DNA测序结果来验证实时PCR检测结果的准确性。

1.4 代谢表型的定义 依据文献[15，16]可分为4种不同的代谢表型：①慢代谢型：含有2个使酶活性完全丧失的等位基因(突变纯合子)；②中间代谢型：含有2个使酶活性减弱的等位基因(突变纯合子)；③快代谢型：正常表型，具有2个正常等位基因(野生型纯合子)，或具有1个使酶活性减弱或丧失的突变等位基因(突变杂合子)；④超快代谢型：含有多个拷贝或具有使酶活性增强的等位基因。

1.5 不同人群CYP450亚型突变等位基因频率对比分析 应用主题词或关键词 “P450”、“cytochrome”、“gene”和“polymorphisms”，检索1996年1月至2009年12月PubMed、OVID及中国生物医学文献光盘数据库，收集高加索人群、日本人群以及非洲黑种人群的CYP450亚型等位基因频率的文献，并辅以文献追溯的方法，手工检索相关的参考文献，入选的文献需有相关的基因型和等位基因频率的数据。各人群和各SNPs位点均选择1篇样本量大、方法可靠和种族特点明确的文献与本研究中国汉族分析人群CYP450 6个亚型的8个SNPs位点等位基因频率进行对比分析。

1.6 统计学方法 使用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)统计各SNP位点等位基因频率和基因型频率分布，各SNP位点基因频率行Hardy-Weinberg遗传平衡定律(HWE)检验，P<0.05为差异有统计学意义[17]。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

表2 CYP450 6个亚型的8个SNPs位点突变检测的引物和探针序列

2 结果

2.1 一般情况 300份中国汉族分析人群男性182例，女性118例，年龄0.2～16.0岁，平均年龄(5.0±4.3)岁。

2.2 CYP450亚型各SNP位点基因型和等位基因频率分布 CYP450 6个亚型的8个SNPs位点的PCR基因测序结果见图1。各位点等位基因频率均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，表明样本具有群体代表性(表3)。

如表3所示，CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位点的野生型杂合子基因型频率在本研究汉族分析人群中的分布较高，分别为46.3%、47.0%和43.7%；CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G突变纯合子的频率均高于野生型纯合子的频率(35.3%vs17.7%，41.7%vs14.7%)。CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位点的突变等位基因频率也较高，分别为34.5%、58.8%和63.5%。CYP2C9 1075A>C、CYP2C19 636G>A、CYP2E1 -1053C>T、CYP2E1 7632T>A和CYP3A4 878T>C位点的野生型纯合子基因型频率较高，分别为100%、89.3%、61.3%、58.3%和98.0%，CYP2C9 1075A>C、CYP3A4 878T>C位点的野生型杂合子基因型频率较低，仅为0和2.0%。

图1 CYP450 6个亚型的8个SNPs位点的PCR基因测序结果

Fig 1 Results of sequencing of 8 SNPs in 6 CYP450 subtypes

Notes A:CYP2C9 1075A>C;B,C:CYP2C19 636G>A;D-F:CYP2C19 681G>A/C;G-I:CYP2D6 100C>T;J-L:CYP2E1 -1053C>T;M-O:CYP2E1 7632T>A;P,Q:CYP3A4 878T>C;R-T:CYP3A5 6986A>G

表3 300例中国汉族分析人群CYP450各亚型SNP位点基因型和等位基因的频率分布[n(%)]

Notes 1) The genotype and allele frequencies of another SNP in CYP2C19 681 locus (wild heterozygote GC, mutant homozygote CC, and mutant allele C) were zero, data was not shown

2.3 中国汉族分析人群CYP450各亚型突变等位基因与其他人群的对比分析 CYP3A4 878T>C位点在欧洲高加索人群和非洲黑种人群中未找到相关数据。本研究中国汉族分析人群CYP450 6个亚型8个SNPs位点的突变等位基因频率与日本人群[18～23]较为接近，与欧洲高加索人群[24～28]和非洲黑种人群[29～32]有较大差异。CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T和CYP3A5 6986A>G位点的突变等位基因频率在中国汉族分析人群和日本人群中较高，CYP3A5 6986A>G位点的突变等位基因频率在欧洲高加索人群中分布亦较高。其余5种突变等位基因频率在中国汉族分析人群和日本人群中较低。

图2 CYP450各亚型突变等位基因在不同人群中的分布

Fig 2 The distribution of mutant alleles in CYP450 subtypes in different race population

Notes The data of CYP3A4 878T>C in European Gaucasian and African Black ethnic or regional groups were not found

2.4 中国汉族人群CYP450代谢表型的分布 由表4可见，CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4和CYP3A5的快代谢型和超快代谢型比例分别100%，83.3%，64.7%，95%，100%和58.3%。CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的中间代谢型和慢代谢型比例分别为11.4%、35.3%和41.7%，高于CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的中间代谢型和慢代谢型比例(分别为0，5.0%和0)。由于慢代谢型的划分还需明确该基因其他多态性位点的情况，且该型在人群中的比例较低，可初步提示此3种CYP450亚型的中间代谢型在中国汉族分析人群中的比例较高。CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的快代谢型和超快代谢型的比例非常高，分别为100%、95.0%和100%，由于超快代谢型的划分还需明确该基因其他多态性位点的情况，且该型在人群中的比例较低，初步提示此3种CYP450亚型的快代谢型在中国汉族分析人群中的比例较高。

表4 300例中国汉族分析人群CYP450代谢表型的分布[n(%)]

Tab 4 Metabolic phenotype frequencies of CYP450 subtypes in 300 cases of Chinese Han population[n(%)]

SubtypesPMand/orIMEMand/orUMCYP2C91075C/C0(0)1075A/A；1075A/C300(100)CYP2C191)681A/Aand636G/G681G/Gand636A/A681A/Aand636G/A681G/Aand636A/A681A/Aand636A/A34(11．4)681G/Gand636G/G681G/Gand636G/A681G/Aand636G/G250(83．3)CYP2D6100T/T106(35．3)100C/C；100C/T194(64．7)CYP2E12)7632A/Aand⁃1053C/C7(2．3)7632T/Tand⁃1053C/C7632T/Aand⁃1053C/C7632T/Aand⁃1053C/T7632T/Tand⁃1053C/T7632T/Tand⁃1053T/T7632T/Aand⁃1053T/T285(95．0)CYP3A4--878T/T；878T/C；878C/C300(100)CYP3A56986G/G125(41．7)6986A/A；6986A/G175(58．3)

Notes PM:Poor metabolizer; IM: Intermediate metabolizer;EM: Extensive metabolizer; UM:Ultrarapid metabolizer;1) The metabolic phenotype of individuals with genotype combination as ′681G/681A and 636G/636A′ [16(5.3)] could not be determined. 2) The metabolic phenotype of individuals with genotype combination as ′7632A/7632A and -1053C/-1053T′ [5(1.7)], ′7632A/7632A and -1053T/-1053T′ [3(1.0)] could not be determined；"-":because of the increasing effect of this variant, the PM and/ or IM could not be existed

3 讨论

本研究结果显示，CYP2C19 681G>A/C、CYP2D6 100C>T、CYP3A5 6986A>G突变等位基因的频率较高，均可引起酶活性降低或缺失，说明在中国汉族人群中可能有一部分个体因为这3个位点的突变引起相应酶活性的降低，可入选本研究后续优化SNPs位点的研究；而CYP2C9 1075A>C、CYP2C19 636G>A和CYP3A4 878T>C突变等位基因的频率则较低，提示由此引起的相应酶活性的改变对中国人群的影响可能较小。本研究CYP2C9 1075C等位基因频率为0，与既往的研究结果(3.5%)[33]不一致，可能与人群的选择不同有关。可在后续的研究中，考虑增加其他多态性较高或与代谢表型紧密相关的SNPs检测位点，从而筛选出能代表中国汉族人群遗传特点的SNPs位点优化组合方式。

另外，通过与不同种族人群的既往研究结果对比分析发现，中国汉族分析人群CYP450各亚型的突变等位基因与高加索人群和黑种人群有种族上的差异，而与日本人群较为接近。提示CYP450基因型存在种族差异。但这些既往研究多以单个亚型进行研究，而本研究则对CYP450 6个亚型的8个SNPs位点进行检测，获得了更多的关于中国汉族人群CYP450不同亚型的遗传学数据，对个体化用药的指导更具意义。

目前，调整个体化用药主要通过血药浓度的监测，而利用基因检测来指导个体化用药还处于起步阶段，虽在部分药物如华法林、β2受体拮抗剂已有小范围的推广[21,34]，但尚无临床通用指导标准。采用探针药物是目前确定代谢表型的公认方法，但需受试者服用探针药物，采血测定原药和代谢产物的血药浓度，依从性较差。因此根据多态性位点确定代谢表型是一种可行的方法。本研究选取的CYP450 6个亚型的8个SNPs位点均为已被既往研究证实可影响其代谢表型的位点。由于药物代谢酶的编码基因常存在多个功能性多态性位点，仅根据一个多态性位点来判断个体的代谢表型有一定局限性，因此本研究采用基因分型结果来预测代谢表型可能有一定误差。但本研究将慢代谢型与中间代谢型、快代谢型与超快代谢型进行合并分析，由于慢代谢型和超快代谢型在人群中的比例非常低，因此本研究的结果仍可初步反映中国汉族人群各CYP450亚型的中间代谢型和快代谢型的分布态势。

不同代谢表型的个体应采用不同的用药方案。本研究结果显示，中国汉族分析人群中CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5中间代谢型和慢代谢型占较高比例(分别为11.4%、35.3%和41.7%)，因此建议对CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5进行SNPs的检测，确定其代谢表型，如为中间代谢型或慢代谢型的患者应适当减少用药剂量或延长用药间隔时间，并密切监测药物的不良反应。而对于CYP2E1和CYP3A4超快代谢型个体，则可适当增加用药剂量或缩短用药间隔时间。

除本研究选取的SNPs外，仍存在其他可影响CYP450代谢表型的遗传变异，如插入、缺失、随机重复和微卫星等[35～37]，以及其他未发现和未入选的SNPs。进一步检测影响CYP450代谢表型的其他遗传变异、或补充SNPs检测位点，以提高预测结果的准确性；但过多位点的入选会增加经济和人力成本，不利于该技术的推广应用。因此，如何平衡好这两者的关系，是将来进行个体化用药研究所面临的主要问题。

本研究的不足之处和局限性：①样本人群可能存在选择偏倚；②未采用探针药物确定代谢表型，使本研究代谢表型结果存在一定误差。

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