干扰素γ释放试验在结核感染和活动性结核病诊断中的应用

孙 琳 综述 申阿东 审校

由结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是严重危害人类健康的重要传染病之一。近年来，随着耐药MTB的流行和HIV感染增多，全球结核病疫情进一步加重，结核病成为仅次于AIDS的第二大致死性感染性疾病“杀手”。据WHO统计[1]，全世界现有结核病患者约18.6亿，每年新发结核病患者约890万。第四次全国结核病流行病学调查显示[2]，全国已有1/3以上的人口感染了结核菌，其中活动性肺结核病患者450万，每年约25万人死于结核病，是其他各类传染病死亡人数总和的2倍。因此，筛选结核感染高危人群，加强结核感染和活动性结核病患者的诊断，已成为结核病控制工作的重点。

结核菌素皮肤试验(PPD)用于诊断结核感染和活动性结核病已有100多年。虽然有研究表明，PDD试验阳性结果与患者当前或未来是否患结核病具有相关性[3，4]。但是PDD试验在临床应用中存在一定的局限性，PPD试验所用的抗原，即纯化蛋白衍生物是MTB培养过滤物沉淀制成的成分不明确的复合抗原，其中大多数为卡介苗菌株和分枝杆菌共同的抗原，可引起机体迟发型变态反应而导致假阳性结果。在免疫抑制者、新近感染者、营养不良患者以及幼儿中，由于其机体的免疫应答减弱，PPD试验会出现假阴性结果，导致其敏感度降低。随着免疫学技术的发展，通过酶联免疫法发展而来的IFN-γ释放试验作为一种新型的免疫学诊断方法，检测特异的T细胞释放的IFN-γ，在结核病诊断中具有较高的敏感度和特异度。本文就IFN-γ释放试验在活动性结核病和结核感染诊断中的应用进行综述。

1 IFN-γ释放试验的基本原理

IFN-γ释放试验是利用MTB感染者外周血单个核细胞中存在的结核特异活化的T细胞，在受到MTB特异抗原早期分泌靶蛋白ESAT-6(early-secreted antigenic target-6 )和培养滤液蛋白CFP-10(culture filtrate protein-10 )刺激后分泌IFN-γ而设计。ESAT-6和CFP-10是由MTB基因组RD1区编码的低相对分子质量蛋白,只存在于MTB复合群中,而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌(除外堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌)中缺乏[5]，理论上能区分卡介苗或MTB自然感染所致的PPD试验阳性结果。当机体外周血单个核细胞分别与结核特异的混合抗原A(ESAT-6部分多肽片段)、混合抗原B(CFP-10部分多肽片段)以及阳性对照植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)共同培养时，如果存在针对MTB的效应T细胞时，加入的MTB特异混合抗原多肽将刺激这些效应T细胞分泌IFN-γ。分泌的IFN-γ被标记而得以测定，从而可以推测体内是否存在对MTB反应的效应T细胞，对MTB感染进行辅助诊断。IFN-γ释放试验目前的商品化试剂盒产品主要为T-SPOT-TB(T-SPOT)试剂盒(英国Oxford Immunotec Limited)、QuantiFERON-TB Gold(QFT-G)试剂盒和QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)试剂盒(澳大利亚 Cellestis Limited)。

2 IFN-γ释放试验在结核病诊断中的准确性研究

2.1 敏感度评价 目前对于IFN-γ释放试验的敏感度研究主要在确诊结核病(细菌培养阳性)和临床诊断结核病患者中进行。在近几年发表的8篇文献[6～13]评价了QFT-GIT试验在确诊结核病患者中的敏感度，共纳入患者751例，QFT-GIT试验的汇总敏感度为81%；5/8篇文献[7,8,11～13]对QFT-GIT试验和PPD试验进行了比较，2/5篇文献认为PPD试验敏感度高于QFT-GIT试验(P﹤0.01)，3/5篇认为2种试验的敏感度差异无统计学意义。6/8篇文献[14～19]评价了QFT-GIT试验在临床诊断结核病患者中的敏感度，共纳入患者379例，QFT-GIT试验的汇总敏感度为81%，4/6篇文献[15,16,18,19]对QFT-GIT试验和PPD试验进行了比较，Raby等[15]认为QFT-GIT试验敏感度高于PPD试验(P﹤0.01)，3/6篇[16，18，19]认为2种试验的敏感度差异无统计学意义(表1)。

有9篇文献[8,12,19～25]评价了T-SPOT试验在确诊结核病患者中的敏感度，共纳入患者640例，T-SPOT试验的汇总敏感度为94%；参考文献[8,12,19,24,25]对T-SPOT试验和PPD试验进行了比较，2种试验的敏感度差异无统计学意义。10篇文献[17,18,26～33]评价了T-SPOT试验在临床诊断结核病患者中的敏感度，共纳入患者510例，T-SPOT试验的汇总敏感度为86%；参考文献[17,18,26～29,32]对T-SPOT试验和PPD试验进行了比较，Lee等[26]和Kang等[28]认为T-SPOT试验敏感度高于PPD试验(P﹤0.01)，参考文献[17,18,27,29,32]认为2种试验的敏感度差异无统计学意义(表2)。

表1 QFT-GIT试验和PPD试验在结核病诊断中的敏感度评价结果(n)

注 1)确诊结核病患者主要为培养阳性患者，部分文献纳入了PCR诊断阳性者；2)由于免疫细胞对阳性质控孔中的PHA反应弱，导致结果不可信；NR：未报告

表2 T-SPOT试验和PPD试验在结核病诊断中的敏感度评价结果(n)

注 1)确诊结核病主要为MTB培养阳性患者，部分文献纳入了PCR诊断阳性者；2)由于免疫细胞对阳性质控孔中的PHA反应弱，导致结果不可信；NR：未报告

有部分研究同时进行了上述3种试验方法的评价，2篇文献[8,12]纳入了确诊结核病患者， 其中Chee等[12]认为PPD试验和T-SPOT试验的敏感度高于QFT-GIT试验。5篇文献[17,18,26～28]纳入了临床诊断结核病患者，Lee等[26]认为T-SPOT试验的敏感度高于QFT-GIT试验和PPD试验(P<0.01)；Kang等[28]认为T-SPOT试验和QFT-GIT试验的敏感度高于PPD试验(P<0.01)。

上述结果表明，不同文献报道的各试验的敏感度差别较大，原因主要包括：部分研究纳入的结核病患者仅为临床诊断，即无确切的病原学诊断证据；不同的研究采用的试验方法及诊断标准不同；在不同研究中，比较QFT-GIT和T-SPOT试验与PPD试验的敏感度，两种方法所采用研究对象不同。

2.2 特异度评价 目前对于 IFN-γ释放试验的特异度研究主要在低危人群中筛查结核感染患者中进行。在已发表的文献中(表3和4)，参考文献[6,8,11,13]共纳入患者388例，QFT-GIT试验的汇总特异度为99%，Detjen[8]和Ruhwald[13]认为QFT-GIT试验的特异度高于PPD试验(P﹤0.01)。4篇文献[8,25,26,34]共计纳入患者240例，T-SPOT试验的汇总特异度为89%。Detjen[8]和孙琳等[25]认为T-SPOT试验的特异度高于PPD试验，孙琳等[25]还认为无论PPD试验阳性标准取10或15 mm，其特异度均低于T-SPOT试验。而Lee等[26]认为PPD试验阳性标准提高至15 mm后，其特异度高于T-SPOT试验。

根据IFN-γ释放试验的基本原理， T-SPOT试验、QFT-GIT试验所使用的抗原为MTB特异性抗原，其结果不受卡介苗接种的影响，因此多数学者认为其特异度要高于PPD试验。而PPD试验特异度较低的原因可能为卡介苗接种或非MTB感染导致的假阳性结果。该结论已在卡介苗接种人群或非MTB性淋巴腺炎患者中得到了验证。

由于目前尚无诊断结核感染的金标准，IFN-γ释放试验和PPD试验的特异度评价也存在一定的局限性。首先，感染危险因素不同，如结核感染率和卡介苗接种率等，从而造成各研究所纳入的低危人群不尽相同；其次，即使在低危人群中也可能存在结核感染者，研究者认为的部分假阳性结果可能就是结核感染者。总之，当前对IFN-γ释放试验特异度研究的数据及样本量较小，需要进一步扩大样本量进行验证。

表3 QFT-GIT试验和PPD试验在结核病诊断中的特异度评价结果(n)

注 NR：未报告

表4 TSPOT-TB试验在结核病诊断中的特异度评价结果(n)

注 NR：未报告

2.3 一致性检验 有3篇文献[35～37]认为IFN-γ释放试验和PPD试验的一致性在卡介苗未接种人群中高于卡介苗接种人群。2篇文献[38,39]纳入的卡介苗未接种人群中，接近50% PPD试验阳性患者的IFN-γ释放试验结果阴性。同时有研究对QFT-GIT试验和T-SPOT试验的一致性进行了分析显示，2种试验的一致性较好(κ=0.57～0.70)[21,26,27]。

在结核感染和结核病诊断中，影响一致性的因素较多，包括诊断标准、当地的结核感染率、确诊结核病患者的比例、研究对象的卡介苗接种史、年龄和种族，此外还包括是否合并其他疾病，如非MTB或免疫缺陷病等。因此，在当前的研究中，IFN-γ释放试验和PPD试验一致性研究的结论差别较大[40～45]。就年龄而言，随着年龄的增长，机体接触外界环境中MTB的概率增加。因此，MTB感染率随年龄而增加，IFN-γ释放试验和PPD试验的阳性率也随之升高。

若研究对象需同时行PPD试验和IFN-γ释放试验，而PPD蛋白(MTB PPD)的注射是否会对之后的IFN-γ释放试验产生影响，目前结论不一。有研究认为研究对象的选取、两种试验间隔时间和PPD蛋白的剂量等均会影响试验结果。但也有研究认为，注射PPD蛋白后，结核感染者、卡介苗接种者以及非MTB感染者的记忆性免疫应答反应均会被激活，但IFN-γ释放试验只会识别结核感染者的T细胞，因此其结果不受之前PPD试验的影响。

3 IFN-γ释放试验在结核病诊断中的应用价值研究

3.1 IFN-γ释放试验在结核病发病风险预测中的应用 IFN-γ释放试验作为诊断性试验的一个重要作用就是预测结核感染者发展为活动性结核病的概率。有研究指出，PPD试验阳性者中有5%～10%会发展为活动性结核病[4,46]。但关于IFN-γ释放试验在此方面的研究数据较少。

Aichelburg等[16]对HIV感染者进行了为期19个月的跟踪调查，发现36例QFT-GIT试验阳性的HIV感染者中，3例(8.3%)在19个月内发展为活动性结核病；而705例QFT-GIT试验阴性的HIV感染者中均未发现有活动性结核病症状(P<0.001)。Diel等[47]在随访研究中，共纳入601例与痰培养阳性患者密切接触者，结果发现，PPD试验结果阳性者219例，仅5例(2.3%)发展为活动性结核病；QFT-GIT试验结果阳性者41例，6例(14.6%)发展为活动性结核病。提示QFT-GIT试验准确性明显高于PPD试验(阳性标准为≥5 mm)。该研究进一步分析发现，59%的研究对象PPD试验硬结直径为5～9 mm。将PPD试验阳性标准提高至≥10 mm时，PPD试验结果阳性者仅有5.6%后来发展为活动性结核病，该结果与QFT-GIT试验差异无统计学意义(5.6%vs14.6%)。

Stout等[48]认为QFT-GIT试验和PPD试验在预测结核病中均具有较高的应用价值，其敏感度分别为100%和83%。Kik等[49]对荷兰的339例移民随访2年后得到了同样的结论。PPD试验结果：阳性标准为≥10 mm时9/ 288例(3.1%)，阳性标准为≥15 mm时7/184例(3.8%)发展为活动性结核病。QFT-GIT试验阳性者5/ 178例(2.8%)和T-SPOT试验阳性者6/181例(3.3%)均发展为活动性结核病，上述差异无统计学意义。

3.2 IFN-γ释放试验在结核病接触者中的应用 活动性结核病具有很强的传染性，结核病最主要的传播途径为呼吸道传播。因此与活动性结核病患者，特别是排菌结核病患者密切接触后，易导致结核菌感染或结核病的发生。因此，对结核病患者接触者进行及时有效的筛查、及早发现结核感染或活动性结核病患者，可以有效地控制结核病的流行。已有研究对QFT-GIT试验和T-SPOT试验在与结核病接触者中的应用价值进行了评价(表5)。有研究发现，IFN-γ释放试验阳性率与近期结核病密切接触史的相关性明显高于PPD试验，提示IFN-γ释放试验对无感染的“窗口期”，具有更高的敏感度。

表5 QFT-GIT试验和(或)T-SPOT试验在与结核病患者接触者中的应用(n)

在英国的一项研究中，Ewer等[50]对与1例传染性结核病患儿接触的535名学生进行了检测，并将研究对象按结核感染暴露程度(包括接触时间和距离)进行了分级，结果发现，IFN-γ释放试验和PPD试验一致性较好(κ=0.72)，而接触时间与结核菌感染暴露程度相关性更高。韩国的研究者对接触过结核病患者的医护人员进行了结核菌感染的筛查，并按接触程度分为：频繁、直接接触组和无明确密切接触史组。PPD试验的阳性率分别为42.9%和34.0%(P=0.42)；IFN-γ释放试验的阳性率分别为40.0%和10.6%(P=0.002)，两种试验的一致性较差；提示在结核病病房工作的时间长短可能是导致结核感染发生的唯一因素(OR=1.03,P=0.031)，IFN-γ释放试验结果与高危因素的相关性更高[51]。Costa等[52]的研究纳入了1 686名医护人员，结果发现78.3%(1 320名)的研究对象PPD试验硬结直径≥10 mm，33.1%(437/1 320名)为IFN-γ释放试验阳性。PPD试验硬结直径≥15 mm者中49.2% IFN-γ释放试验阳性，但两种试验的一致性并不高。1 686名研究对象中，除9名被诊断为活动性结核病，其PPD试验和IFN-γ释放试验均为阳性外，大部分研究对象为PPD试验阳性而IFN-γ释放试验阴性。该部分研究对象大都接种过卡介苗，且通过胸部X线、临床查体等均未发现活动性结核病存在。因此，研究者认为在这种情况下，应该将两种试验进行结合，优势互补，对于PPD试验阳性者应该行IFN-γ释放试验进行验证，从而提高诊断的特异度。

3.3 IFN-γ释放试验在儿童结核病诊断中的应用 评价IFN-γ释放试验在儿童结核病诊断中的准确性，其影响因素较多，如病原学确诊率低、近期接种过卡介苗、年龄和免疫状态等。<5岁儿童中活动性结核病和严重结核病的比例高于年长儿，且婴幼儿对MTB抗原和PHA的免疫应答较年长儿低，提示机体对MTB的免疫应答存在差异。因此，研究对象的选择会显著影响诊断方法的准确性。

Kampmann等[18]纳入了25例确诊结核病患儿，PPD试验、QFT-GIT试验和T-SPOT试验的敏感度分别为88%(阳性标准为≥10 mm)、87%和58%，三种试验差异均无统计学意义(P=0.05)。由于非MTB感染的影响，PPD试验的特异度仅为22%，而IFN-γ释放试验在儿童结核病诊断中的特异度高于PPD试验。Detjen等[8]的研究纳入了确诊结核病患儿28例、非MTB性淋巴结炎患儿23例和其他呼吸系统疾病患儿22例，分别行QFT-GIT、T-SPOT和PPD试验，结果发现三种试验的敏感度分别为93%、93%和100% (P=0.15)，特异度分别为100%、98%和58%。IFN-γ释放试验的特异度明显高于PPD试验。PPD试验在非MTB性淋巴结炎患儿中的特异度仅为10.5%，而在其他呼吸系统疾病患儿中特异度高达100%。另外QFT-GIT和T-SPOT试验在诊断中的一致性较好，可达95.6%(κ=0.91)。IFN-γ释放试验和PPD试验的一致性在确诊患儿和卡介苗未接种患儿中较高，分别为93%和100%。可见，IFN-γ释放试验受患儿年龄、卡介苗接种等因素的影响较小，在儿童结核病诊断中具有和PPD试验一样较高的敏感度。而PPD试验的特异度明显较低，主要原因在于非MTB感染和卡介苗接种导致的假阳性结果。QFT-GIT试验和T-SPOT试验受其影响较小，具有较高的特异度。

Nicol等[58]将IFN-γ释放试验和PPD试验用于儿童结核病的诊断以及对抗结核药物治疗效果进行评估。结果发现70例临床诊断结核病患儿中仅49例为IFN-γ释放试验阳性。因此，依据症状、体征等进行临床诊断的患儿并非均为结核病，可能存在误诊。在对结核病患儿的抗结核治疗1、3和6个月时进行随访，发现IFN-γ释放试验在1个月时未发生改变，3和6个月时降低。研究者认为，IFN-γ释放试验对儿童抗结核药物疗效评估有一定的应用价值，但并不是快速、灵敏的指标。

目前，相对成人研究对象，评价IFN-γ释放试验在儿童结核病诊断中的应用比较困难，且大多仅限于某个年龄段，由于儿童相关研究数据较少，现有结论可能会存在一定的不确定性。另外，由于婴幼儿的免疫系统尚不成熟，淋巴细胞对PHA的应答较弱，常会由于缺乏阳性质控而使结果不可信。再次，每项IFN-γ释放试验至少需要2 mL外周静脉血，而婴幼儿取血比较困难。

3.4 IFN-γ释放试验在HIV/MTB双重感染人群中的应用 HIV/MTB双重感染人群逐年增多，结核病已经成为AIDS患者最常见的并发症。随着HIV的流行加重，由MTB感染发展为活动性结核病的比例以及结核病的严重程度逐渐增加。同样，结核病也会加快AIDS患者的病情进展。AIDS和结核病相互影响，造成恶性循环。因此，加强HIV/MTB双重感染人群的诊断，及早给予治疗，是全球AIDS和结核病控制工作的新重点。

乌干达[59]一项的晚期AIDS患者进行的研究显示，由于其CD4+T细胞数很低，平均每毫升为49个细胞，导致25.5%(54/212例)的T-SPOT试验结果不可信，其余60.1%(95/158例)的试验结果为阳性。T-SPOT试验的敏感度为73%，特异度为54%。研究者认为AIDS晚期患者作为结核病感染高发人群，T-SPOT试验具有很好的诊断价值。

但也有研究者得出了不同的结论。Seshadri等[60]的研究纳入了53例痰培养阳性的肺结核患者，其中HIV阳性组13例，阴性组40例。PPD试验在两组研究对象中的敏感度分别为54%和100%(P<0.000 1)；QFT-GIT试验在两组中的敏感度分别为23%和70%(P=0.002 9)。赞比亚的研究[15]也得到了相似的结论，即在HIV感染者中QFT-GIT试验和PPD试验的敏感度均低于HIV阴性人群。同时CD4+T细胞数与两种试验的假阴性结果具有相关性。研究者认为，HIV感染会明显降低PPD试验和QFT-GIT试验在诊断活动性结核病中的敏感度，尚需要进一步的试验来验证QFT-GIT试验在AIDS患者中应用的有效性(表6和7)。

表6 QFT-GIT试验在HIV/MTB双重感染人群中的应用(n)

注 1)仅在QFT-GIT试验结果阳性者中行PPD试验；NR：未报告；+：阳性；-：阴性

表7 T-SPOT试验在HIV/MTB双重感染人群中的应用(n)

注 1)仅在QFT-GIT试验结果阳性者中行PPD试验；+：阳性；-：阴性

4 IFN-γ释放试验临床应用选择

IFN-γ释放试验和PPD试验均可用于MTB感染的筛查和活动性结核病的诊断，从而使患者得到及时的抗结核治疗。但IFN-γ释放试验的优点在于不受卡介苗接种或非MTB感染影响，24 h即可得结果；PPD试验需要患者重返医院进行结果读取，且结果读取有一定的主观性等。但其缺点在于对操作技术要求和成本较高。同时关于IFN-γ释放试验和PPD试验敏感度、特异度及一致性等方面的研究结果不尽相同，因此在实际应用中如何选取合适的诊断试验方法，要根据实际情况如操作技术要求和成本等方面综合考虑。

总之，对IFN-γ释放试验在结核感染筛查和结核病诊断中适用的情况总结如下：

可优先选择IFN-γ释放试验的人群：①由于PPD试验需要72 h后读取结果，对于无法或不方便再次返回的被检查者；②接种过卡介苗的人群；③无法行PPD试验者，如严重皮肤疾病、免疫缺陷者等。

PPD试验结果阴性的人群，IFN-γ释放试验作为辅助诊断：①结核感染高危人群如免疫抑制或缺陷人群、婴幼儿等；②临床医生根据患者的症状、体征和影像学检查诊断为疑似结核病的患者。

PPD试验结果阳性的人群，IFN-γ释放试验作为排除诊断：①怀疑PPD试验结果阳性为卡介苗或非MTB的交叉反应所致；②无结核病接触史等危险因素的健康人群。

PPD试验结果存在争议或无法判读时的人群，IFN-γ释放试验作为补充诊断：①PPD试验的结果处于阳性临界值时；②其他因素影响导致结果无法判读时。

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