清凉膏中靛玉红的含量测定

钱 嘉， 张兴德， 夏 勤， 吕游春

肿痛型外痔是肛肠科常见的疾病，临床多采用保守治疗。目前所用的市售外用制剂多为马应龙麝香痔疮膏。清凉膏是名老中医的经验方，由青黛、乳香、没药、黄连等药组成，为南京市中医院医院制剂(批准文号Z04000824)，应用已20余年，临床疗效佳。现行标准质量控制手段过于简单，没有规定制剂中君药青黛中的主要成分靛玉红的含量测定方法，制剂质量难以保证。为有效控制制剂质量，笔者建立高效液相色谱法测定靛玉红含量的方法，为建立该制剂的质量标准提供参考依据。

1 仪器与试药

SPD-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；HH-S型水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)；索氏提取器(东方科仪)。清凉膏(南京市中医院医院制剂，批号：081124)；靛玉红标准品(中国药品生物制品检定所，批号：717-200204)。色谱纯甲醇(江苏汉邦科技有限公司)；分析纯醋酸(南京化学试剂有限公司)；重蒸水自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为AKZONOBEL Kromasil C18(250 mm×4.6 mm)。流动相为甲醇∶0.2%醋酸(67∶33)，柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为289 nm[1]。

2.2 标准品溶液的制备 取靛玉红标准品约3.76 mg，精密称定后置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得标准品储备液。精密量取2 mL标准品储备液置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，即得浓度为7.52 μg/mL的靛玉红标准品溶液。

2.3 供试品溶液的制备 称取清凉膏制剂5 g，精密称定，用滤纸包裹后放入索氏提取器中，加甲醇100 mL，提取4 h后，将提取液过滤，浓缩，置容量瓶中，定容至25 mL。

2.4 专属性试验 按处方组成称取除青黛以外的其余药物并按照清凉膏制备工艺制成缺青黛的阴性制剂，同供试品溶液的制备方法制备成阴性供试液。取靛玉红对照品溶液、供试品溶液、阴性供试液各10 μL，按2.1项下的色谱条件进样，测定，结果为，峰1为靛玉红的色谱峰，保留时间为23.028 min，在阴性供试液的色谱图中靛玉红相应的保留时间处无色谱峰，说明阴性无干扰(图1～3)。

图1 靛玉红对照品色谱图

图2 供试品溶液色谱图

图3 阴性供试液色谱图

2.5 线性关系考察 取对照品储备液，分别稀释至浓度为1.88 μg/mL、3.76 μ/mL、7.52 μg/mL、 11.28 μg/mL和 18.80 μg/mL的对照品溶液，分别取样10 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，以靛玉红的质量浓度为横坐标，得到线性回归方程:y=59 989x+8 772.6(r=0.999 9)。结果表明，在1.88～18.8 μg/mL范围内浓度与峰面积有良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取浓度为7.52 μg/mL靛玉红对照品溶液10 μL，依法测定5次，RSD为1.61%(n=5)。结果表明，该方法精密度较好。

2.7 稳定性试验 取同一对照品溶液分别于0、2、4、8、12和24 h测定，RSD为2.60%，结果表明，样品溶液在24 h内稳定。

2.8 重现性试验 取同批供试品(批号：081124)，平行5份，按供试品溶液同法制备，精密吸取10 μL，按2.1项下的色谱条件测定，RSD为2.69%(n=5)。

2.9 回收率试验 取已知含量重现性项下的样品(批号：081124，含量：7.29 μg/g)，平行5份，分别精密加入浓度为3.76 μg/mL的靛玉红对照品溶液0.5 mL，按2.3方法进行处理，具体结果见表1。

表1 回收率测定结果(n=5)

2.10 样品含量测定 取三批清凉膏制剂，每批取约5 g，精密称定，按2.3方法处理样品，照2.1色谱条件进行含量测定，结果见表2，三批清凉膏制剂中靛玉红含量为7.25 μg/g。

表2 含量测定结果(n=3)

3 讨论

以甲醇∶水=70∶30；甲醇∶水=67∶33；甲醇∶0.1%醋酸水=67∶33；甲醇∶0.2%醋酸=67∶33为流动相分别进行考察，结果显示流动相为甲醇:0.2%醋酸为67:33时，各色谱峰能完全分离且峰形良好。

制剂样品处理常采用超声提取法、热回流法等常规提取方法，提取效率往往一般[2-3]。索氏提取法又称连续回流提取法，此法可使制剂中的有效成分连续不断地被溶剂萃取，既节约溶利又提高萃取效率。本实验的研究对象为软膏剂，其基质通常影响有效成分的提取，索氏提取法可最大程度地从基质中提取有效成分，为适宜的提取方法。

靛玉红可溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚、甲醇等中等极性的溶剂中。我们分别以氯仿、乙酸乙酯、甲醇为溶剂进行样品制备，结果三种样品含量接近，分离效果与峰形相差亦不大，考虑到氯仿毒性较大，而乙酸乙酯试剂成本较高，故选择甲醇作为提取溶剂。

[1] 游勇基,黄碧云.青黛中靛玉红含量测定方法的研究[J].海峡药学,2007,19(12):38-41.

[2] 程力惠,李晓蒙.高效液相色谱法测定青黛中靛玉红的含量[J].时珍国医国药,2007,18(5):1066-1077.

[3] 张青松,尹文清,陈柳生,等.青黛中靛玉红提取溶剂的改进[J]. 广西师范大学学报.2006,24(3):58-60.