金霉素链霉菌发酵培养基的优化

高 山，李宁环，胡 平，何义发

(1.湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000;2.恩施职业技术学院 生物工程系，湖北 恩施 445000)

金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)，是链霉菌(Streptomyces)的一种，因能产生金霉素(chlortetracycline，即CTC)而得名.金霉素(CTC)是属于四环素类的一种广谱抗生素，在医疗、畜牧业和农业上有广泛的用途，尤其在畜牧业上是用于饲料药物添加剂的八大抗生素产品之一.金霉素以其抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低的特点以及其生产技术成熟和生产成本低的优点，成为了目前及今后较长一段时间内在饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂.金霉素的生物合成很复杂，影响金霉素发酵的因素也很多，如种子质量、培养基组成、工艺条件以及发酵过程的代谢调控等[1].关于金霉素的研究多是从影响金霉素发酵的工艺条件[2]或者代谢调控方面[3]着手，目前还没有专门针对发酵培养基组成方面的研究报道.本研究通过外在条件的控制并调整培养基的营养成分来达到高效生产四环素类抗生素的目的，为工业化生产此类抗生素及科学研究提供一个理论和应用基础.目前关于链霉菌培养条件优化的研究报道，仅仅采用单因素法，如研究接种量、种龄、酵母粉、温度、PH等对金霉素发酵的影响[1]，也有通过物理或化学诱变选育金霉素高产菌的研究[4]，及通过原生质体诱变金霉素链霉菌育种的研究[5]，等.一般都是通过摇瓶发酵后再上大发酵罐进行生产性能测定.本文借鉴了前人的部分研究成果，先采用单因素试验，随后利用正交设计优化金霉素链霉菌的发酵培养基.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)，购于中国农业微生物菌种保藏中心(Agricultural Culture Collection of China， ACCC)，菌株编号为ACCC40090.生物测定指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus),来自湖北民族学院生物基础实验教学示范中心保藏菌株.

1.1.2 标准品 金霉素标准品购自北京万诚博达科贸有限公司.

1.1.3 培养基 活化培养基：高氏1号培养基[6].种子培养基(%)[4]：玉米淀粉4.0，黄豆粉2.0，氯化钠0.2，硫酸铵0.3，碳酸钙0.4，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，硫酸镁0.025，磷酸二氢钾0.025，pH7.0～7.2.发酵培养基(%)[1～4,7]：玉米淀粉，蛋白胨，酵母膏，硫酸铵，氯化钠，磷酸二氢钾,硫酸镁等.

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与培养 分别配制高氏1号液体和固体斜面培养基，灭菌.将预先保藏在冷冻干燥管中的金霉素链霉菌菌种在无菌操作台上先用挫刀或镊子直接敲下安瓿管的顶端，若敲下的孔口太小，可用灭菌的镊子处理孔口处，使开口处为合适大小即可.用无菌吸管，吸取0.3～0.5 mL适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状.取0.1～0.2 mL菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面，剩余的菌液(3～4 mL)，注入适宜的液体培养基内，然后在30℃下培养，液体摇瓶在200 r/min下震荡培养.将活化培养一天的菌种转接试管斜面，同样温度条件下培养4～5 d，即可见斜面孢子生长良好，于4℃冰箱中保藏.

根据试验需要配制一定量牛肉膏蛋白胨培养基，分装一定数量的试管斜面，余下的用250 mL三角瓶保存待用.将试管斜面上的指示菌种金黄色葡萄球菌转接于新鲜的试管斜面若干，37℃培养待生长良好时置于4℃冰箱中保藏，作为试验用的指示菌种.

1.2.2 种子和发酵培养基的配制 按配方配制，加有一定量玻璃珠，以使摇瓶中的菌种分散并均匀而快速的生长,具体配制过程可以参考文献[7].

1.2.3 种子培养 将高氏1号斜面上生长良好的菌体用接种钩挑取1.0 cm2左右的菌体放入种子摇瓶里，由于链霉菌菌落与培养基连接紧密，不易挑起，因此可以连同培养基一起放入装液量为50 mL/250 mL[2,4]种子摇瓶.在30℃，230 r/min下震荡培养20～24 h[2,4,8].

1.2.4 发酵培养(摇瓶培养) 将震荡培养24 h的种子培养液用10 mL移液管各取5 mL(接种量10%)到各个发酵摇瓶里，发酵摇瓶的装液量为50 mL/250 mL，在30℃，230 r/min下震荡培养5 d后放瓶[2,4].

1.2.5 金霉素生物效价的测定 采用管碟法[9]测定发酵液中金霉素的生物效价.将标准品制成效价为10、20、50、100和200 μg/mL的浓度梯度，用浓度为108个/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液适量为指示菌，于30℃培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径大小，每个效价浓度3次重复，每个重复测定2次，根据抑菌圈直径大小和标准品浓度的关系绘制标准曲线.测量时，将待测发酵液的抑菌圈直径带入标准曲线，得出样品的生物效价.

1.2.6 单因素试验

表1 发酵培养基中主要碳源筛选

表2 发酵培养基中主要氮源筛选

表3 4因素3水平正交试验表L9(34)

图1 管碟法标准曲线

1.2.6.2 发酵培养基中主要氮源的筛选 发酵培养基中所用的氮源种类丰富，可以同时选用多种氮源[1,2,4]，故在本次试验中选择无机氮源和有机氮源搭配.在单因素试验1.2.6.1的基础上，固定培养基中其它成份，变换培养基中主要氮源种类和搭配，保持C/N比约为2∶1[4,7]，考察不同N源对链霉菌发酵产抗生素的影响.本次试验分4组，具体组成如表2所示.培养基中其它成份为：酵母膏4.0 g，磷酸二氢钾1.5 g，氯化钠1.5 g，硫酸镁0.1 g，碳酸钙6.0 g,水1 000 mL,调pH为7.0～7.2.

1.2.7 发酵培养基的正交设计试验 正交试验采用4因素3水平，9组试验，每组3个重复.4因素分别为玉米淀粉，黄豆粉，硫酸铵，酵母粉.其中主要碳源和氮源由单因素试验确定，生长因子及各因素水平范围参考相关研究论文经比较确定[2,4,10].各因素水平表如表3所示.

2 结果与分析

2.1 金霉素生物效价标准曲线的测定

按照方法1.2.5测定不同浓度梯度的标准品产生的抑菌圈直径，其结果见表4，根据表4绘制出标准曲线(如图1)，求得回归方程：y=0.1266x-0.5855；相关系数：R2=0.997 8.试验结果表明：金霉素浓度在10～200 μg/mL范围内，抑菌圈直径和效价的对数值成线性关系，多次重复试验，结果重现性好，相关系数均在0.99以上.

表4管碟法测得的不同浓度标准品的抑菌圈直径

Tab.4 The diameter in different concentrations by cylinder-plate method

抑菌圈直径/mm标准品浓度/μg·(mL)-1102050100200d112.4614.6217.8820.5622.46d212.4414.6817.4220.8422.74d312.6414.5818.1620.6222.30d412.5614.6018.0820.6622.24d512.8015.1217.9820.8223.04d612.7615.2018.0220.8623.10平均值12.6114.8017.9220.7322.65

2.2 金霉素链霉菌发酵培养基中主要碳源的确定

以表1中的组合作为碳源进行发酵试验，最后将经过120 h的发酵液用管碟法平板培养18～24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈，每个平板中3个重复，计算其平均值，结果如表5.

8组试验与对照组相比，其抑菌圈直径均比对照组大，说明高氏液体培养基不是适合试验菌种产抗生素的培养基.1～4组和5～8组比较可知，加了耐高温淀粉酶的发酵培养基发酵产生抗生素的能力普遍偏低，抑菌圈没有或者较小，而以含淀粉的物质为原料作为发酵培养基中的主要碳源成份，其发酵产抗生素的能力普遍较高.由表5可以看出，玉米淀粉组(组1)抑菌圈最大，其生物效价最高，达118.3 μg/mL,说明试验菌种在发酵过程中对玉米淀粉的吸收和利用能力较高，且有利于抗生素这种次级代谢产物的生成，这说明玉米淀粉是此发酵培养基中最佳碳源.

表5 主要碳源筛选试验结果

表6 主要氮源筛选试验结果

2.3 金霉素链霉菌发酵培养基中主要氮源的确定

以筛选出的玉米淀粉为培养基中主要碳源，以硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉为主要氮源进行氮源的筛选试验，结果显示(见表6)，不同氮源对金霉素链霉菌发酵产生抗生素的影响很大，第1组和第3组的抑菌圈明显比第2组和第4组小；由第1组和第3组及第2组和第4组的结果比较可知，在含有相同无机氮源的情况下，比较有机氮源黄豆粉和蛋白胨发现，试验菌种在发酵过程中对黄豆粉的利用率更高；由第1组和第2组及第3组和第4组的结果对比可知，在含有相同有机氮源的情况下，比较无机氮源硝酸钾和硫酸铵发现，试验菌发酵对硫酸铵的利用率更高.由第2组和第4组可知，无机氮源硫酸铵和有机氮源黄豆粉组合是最优组合，故选择以硫酸铵和黄豆粉为发酵用主要氮源.具体结果如表6所示.

2.4 正交试验结果分析

在确定了单因素的最佳培养条件基础上，设计了培养基中玉米淀粉、黄豆粉、硫酸铵和酵母粉的4因素3水平正交组合试验(表7).从表7中可以看出，第1组试验组合为最优水平组合，即当玉米淀粉为100.0 g/L，黄豆粉为50.0 g/L，硫酸铵为6.0 g/L，酵母粉为4.0 g/L时，在此最优水平组合条件下，生物效价为183.2 g/mL，是对照组(高氏培养基)的38倍.对试验结果进行极差分析，求得每个因素在每个水平下的平均值(用K1，K2，K3表示)，并求出其极差R.K值大致反映了每因素的每个水平对试验结果的影响，如表7中玉米淀粉这个因素，K1>K2>K3，这说明玉米淀粉这个因素的第1个水平对试验结果影响最大，第3个水平影响最小；R值为每个因素中3个水平K值的最大值和最小值之差，它反映了某个因素水平的改变对试验结果的影响大小，R值越大，则对应的这个因素对试验结果的影响越大.结果表明(见表7)，正交试验使金霉素链霉菌发酵产抗生素的能力得到了进一步的提高.各因素对抗生素产量影响的主次顺序为酵母粉>玉米淀粉>黄豆粉>硫酸铵，这说明，酵母粉含量对抗生素的产量影响最大，其次为玉米淀粉浓度，再次为黄豆粉浓度，硫酸铵浓度对抗生素的产量影响最小.

表7 正交试验结果与分析

3 结论与讨论

本研究得出金霉素链霉菌发酵时对玉米淀粉利用率较高，且不需添加相应的淀粉酶水解.能有效利用无机氮源，在无机氮源中，对铵盐的利用率要比对硝酸盐的利用率高很多，其原因可能是硝酸盐在菌体内要首先转化成铵盐才能很好地被利用，而现成的铵盐则可以直接被利用.此菌对有机氮源的利用率也很高，其原因可能是有机氮源中包含各种营养成分，补充了培养基中其他营养成分的不足. 在单因素试验基础上进一步通过4因素3水平的正交试验得出金霉素链霉菌发酵产四环类抗生素的最佳培养基组成为：玉米淀粉100.0 g/L，黄豆粉50.0 g/L，硫酸铵6.0 g/L，酵母粉4.0 g/L.经正交优化后的发酵培养基可使试验菌种发酵液的生物学效价达到最大.对正交结果进行极差分析显示，酵母粉含量对抗生素产量影响最大，硫酸铵最小.

培养基中的营养成分理论上虽然包含六大类营养要素，而每种营养要素对菌体的生长都起着重要作用，但每种营养要素(除水外)的种类丰富，尤其是碳源，氮源.可以作为碳源的营养物很多，分为有机碳源和无机碳源，而有机碳源又有很多种，如单糖、多糖、有机酸、醇和酯、淀粉、糖蜜、氨基酸、蛋白质等，还有许多成分复杂的物质，如牛肉膏、花生饼粉等，无机碳源如CO2和碳酸盐；氮源也可分为有机氮源和无机氮源，有机氮源如尿素、氨基酸、蛋白质、牛肉膏、蚕蛹粉等，无机氮源如N2、铵盐、硝酸盐.不同的微生物对不同的营养物质吸收能力不同，对同一种营养物质的吸收利用能力也不一定相同.若要全面考察某种微生物对某种营养物质的吸收利用能力，工作量是相当大的，因此目前为止，还没有专门全面优化设计发酵培养基的研究报道，目前仅有的很少的一部分是关于培养基优化的，则是根据相关资料确定的因素进行正交设计.本研究的优势在于先查阅多种资料，确定可行的适合试验菌种生长并对其影响较大的碳源，氮源，为正交筛选提供一个试验与理论依据，如条件允许，可以做选择更多不同的营养物质进行发酵试验测定其抗菌谱进而比较其优劣.

测定抗生素效价的方法有物理学方法、化学方法和生物学方法.由于生物学方法是以对供试菌的抑菌强度为标准，与临床应用的目的相符，且有灵敏度高、使用样品少等优点，因此被广泛使用.生物效价可用稀释法、比浊法或扩散法测定，其中以扩散法中的管碟法最为常用.它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的试样溶液分别滴到竖置于含有标准供试菌株悬液的琼脂平板上的几个标准不锈钢小管(旧称“牛津小杯”)中，边培养边扩散，经过一段时间后，测量供试菌抑制圈的直径，并与标准曲线作比较后即可测出某试样的效价[11].此外，还有比色法[8]，高效液相色谱法[7]等.另外，本研究所用的指示菌株与其它供试菌种相比[4]，对于金霉素链霉菌发酵液的抑菌圈测定用金黄色葡萄球菌作为供试菌种较好，因其能混合在培养基中生长呈现金黄色，与产生的抑菌圈对比鲜明.

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