一株磷矿粉分解细菌的筛选与鉴定

方亭亭，邓桂芳，刘华中，周毅峰

(湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)

磷是生物重要的营养元素之一，土壤磷素的循环与碳、氮、硫等元素的循环不一样，是一种典型的沉积循环，主要在土壤、植物和微生物之间进行[1].土壤中能被植物吸收利用的有效态无机磷很低，一般只占全磷量的2%～3%[2].许多土壤微生物能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种能力的微生物称为解磷菌或溶磷菌(phosphate-solubilizingmicroorganisms)[3].植物施入不溶性的磷肥，经接种土壤微生物后，促进了植株的生长，增加磷的吸收[4].目前报道解磷细菌类有芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞杆菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)、土壤杆菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、黄杆菌(Flavobacterium)、肠细菌(Enterbacter)、微球菌(Micrococcus)、固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Bradyrhizobium)、沙门氏菌(Salmonella)、色杆菌(Clromobacterium)、产碱菌(Alcaligenes)、节细菌(Arthrobacter)、硫杆菌(Thiobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)；解磷真菌类有青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)；放线菌有链霉菌(Streptomyces)；AM菌根菌[3～5].本研究是从土壤中筛选高效解磷菌，为将其开发解磷微生物菌剂提供基础.

1 材料与方法

1.1 磷矿粉及土样来源

磷矿采自湖北省恩施市白杨坪九根树村,所获磷矿经研磨成粉. 土样采于湖北省恩施市白杨坪九根树村磷矿表层土壤.

1.2 培养基

磷酸钙固体培养基[6]各成分质量分数(%)：葡萄糖 1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，Ca3(PO4)20.5，琼脂2.0，pH7.0～7.5.

磷矿粉固体培养基[6]各成分质量分数(%)：葡萄糖 1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，磷矿粉0.5，琼脂2.0，pH 7.0～7.5.

牛肉膏蛋白胨培养基[7]各成分质量分数(%)：牛肉膏0.4，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，琼脂2.0，pH 7.2～7.5.

发酵培养基[6]各成分质量分数(%)：葡萄糖1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，磷矿粉0.5，pH 7.0～7.5.

表1 菌落形态描述

图1 候选菌解磷能力测定

1.3 土壤解磷菌的分离

参照文献[8]利用稀释倒平板法将土壤分离菌液接到磷酸钙固体培养基的平板上，37℃倒置培养48 h，观察菌落生长情况及其对无机磷的利用状况和透明圈的有无等等.

将在磷酸钙固体培养基上分离到的生长较快的菌株涂布在磷矿粉固体培养基平板上，观察比较各菌的生长状况，记录结果.根据将分离的菌落重新画线，涂布，镜检，至菌体形态一致为止，将菌株用磷矿粉固体培养基斜面进行保藏.选得5个能在选择培养上生长的菌株，并分别命名为DPB1、DPB2、 DPB3、DPB4和DPB5.

1.4 种子液的制备与液体发酵

将初筛的各个菌落进行活化后接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，37℃培养，培养时间以48 h为宜，然后将斜面上的菌落全部刮入100 ml生理盐水中，在旋转式摇床上200 r/min，37℃振荡2 h.

试验设对照组和实验组，每种菌种设三个重复，将在生理盐水中稀释的菌种以10%的接种量接入盛有100 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，对照组接入10%的无菌生理盐水，在旋转式摇床上200 r/min,37℃振荡培养，培养时间为7 d.

1.5 发酵液中有效磷含量的测定

参照文献[9]的方法进行.

1.6 解磷菌DPB5的鉴定

参照文献[8]进行革兰氏染色、芽孢观察.参照文献[10]进行NaCl试验、温度生长试验、V-P测定、明胶液化实验、淀粉水解、接触酶测定、 pH耐受性测定、甲基红反应、脲酶反应等生理生化鉴定.

2 结果与讨论

2.1 解磷菌的菌落形态与筛选

以磷酸钙固体培养基为筛选培养基，采用稀释倒平板法从磷矿表层土壤中分离到5个生长旺盛的典型菌落(命名见1.3)，各菌落表观形态描述见表1.

各菌种降解磷矿的情况见图1，从此图可以看出：对照组、DBP1、DBP3相差不大，但DBP5的解磷能力比对照组及DBP1和DBP3两个菌株大2倍多，比解磷能力较差DBP2和DBP4两个菌株分别高出4.5和2.6倍，并且在从外观也可以看出：DBP5的发酵液颜色较浅，发酵液表层的菌膜较多，其它的相对来说颜色要深一点，发酵液表层的菌膜也相对较少.因此，选择了DBP5作为降解磷矿的优势菌种，并对该菌株进行了初步鉴定.

2.2 DPB5的鉴定

根据DBP5的生理生化试验结果，由《常见细菌鉴定手册》[10]初步确定为芽孢杆菌属(见表2)的枯草芽孢杆菌(B.licheniformis).芽孢杆菌属(Bacilluscohn)的细菌学特性为：细胞呈直杆状，0.5～2.5 μm×1.2～10 μm，常以成队或链状排列，具圆端或方端.细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动.芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境.每个细胞产一个芽孢，生孢不被氧所抑制.好氧或兼性厌氧，具有对热，pH和盐各种各样的生理特性.化能异养菌，具有发酵或呼吸代谢类型.通常接触酶阳性.发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病.

3 小结

试验筛选出解磷能力较强的菌株为DBP5菌株，经过常规的生理生化鉴定发现该菌株为芽孢杆菌属Bacillus的枯草芽孢杆菌B.subtilis.枯草芽孢杆菌具有生长速度快、抗逆性好、稳定性强及能有效抑制有害菌生长等特点[11]，对其具有解磷能力却鲜见报道，对其解磷机理有待于进一步研究.

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