口蹄疫病毒 3AB克隆表达及其抗体间接EL IS A检测方法建立与应用研究

朱文钏 孔繁德 林祥梅 徐淑菲 吴德峰 韩雪清 吴绍强

(1.厦门出入境检验检疫局 福建厦门 361012;2.福建农林大学动物科学学院;3.中国检验检疫科学研究院)

1 前言

口蹄疫 (FMD)是由口蹄疫病毒 (F MDV)引起的偶蹄动物共患的接触性传染病[1]。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,共包括 A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ和亚洲Ⅰ型等 7个血清型以及 80个以上的亚型,血清型之间无交叉免疫现象[2]。FMD呈世界性流行,导致偶蹄动物生产性能下降或死亡,给畜牧业及相关产业如肉、奶、皮、毛等加工业造成巨大的经济损失。控制和消灭口蹄疫的主要方法是接种疫苗和捕杀感染动物,但是在捕杀过程中如何检测隐性感染动物,在接种疫苗时如何区分自然感染动物和疫苗免疫动物一直是重要问题。因此,建立一种有效的鉴别诊断方法以区别这两类动物,检测隐性感染已成为口蹄疫防制技术的关键。

动物感染 FMDV后,体内既可以产生结构蛋白抗体,又可以产生非结构蛋白抗体,而用纯化的 FMDV病毒粒子制备的灭活疫苗免疫动物后不会产生针对病毒的非结构蛋白的抗体,但仍会产生结构蛋白抗体。因此,利用传统 FMDV抗原包被检测 FMDV抗体不能区分是自然感染动物还是灭活疫苗免疫动物,而利用检测血清中非结构蛋白抗体则可以达到此目的。FMDV基因组含有一个大的开放阅读框,编码一个大的聚蛋白,聚蛋白逐级成熟裂解为病毒结构蛋白 (VP1、VP2、VP3、VP4)和非结构蛋白(NSP:L、2A、2B、2C、3A、3B、3ABC、3D等 )[2]。本研究采用原核表达的 FMDV 3AB非结构蛋白作为抗原进行包被,建立能够区分自然感染动物和疫苗免疫动物的 EL ISA检测方法。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒和试剂

DH5α、BL21(DE3)菌株和表达载体 PET-28(a+):由本实验室保存;Taq DNA聚合酶、Prime STAR高保真酶、dNTP、连接酶、各种规格 Marker:购自宝生物 (大连)工程有限公司 (TAKARA);各种限制性内切酶:购自 NEW ENGLAND Biolabs(NEB)公司;异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG):购自 Inalco公司;胶回收试剂盒:购自天根生化科技有限公司;质粒提取试剂盒:购自 OMEGA公司;Ni离子亲和层析树脂:购自 GE公司;咪唑:购自 Sigma-Aldrich;T MB、羊抗猪酶标二抗:购自 Sigma公司;FMDV 3ABC抗体阻断 EL ISA试剂盒:购自 PR I ONI CS公司;其余试剂均为国产分析纯。

2.1.2 仪器

9700 PCR仪:AB I公司;X-22R台式高速冷冻离心机:美国 BECK MAN公司;荣华 ZD-85A气浴恒温摇床:江苏金坛市荣华仪器制造有限公司;GEL-DOC-XR凝胶成像系统:Bio-Rad公司。

2.1.3 血清

2.1.3.1 阴阳性对照血清

经 F MDV 3ABC抗体阻断 EL ISA试剂盒检测OD值接近阳性临界值的猪血清作为本试验建立方法的质控阳性血清;经试剂盒检测阴性的健康猪血清作为阴性对照血清。

2.1.3.2 待检血清

本试验室保存的猪血清。

2.2 方法

2.2.1 FMD非结构蛋白 3AB基因的合成

经 GenBank检索分析,参照已公布的亚洲株(AY687333)选取 3AB基因,根据密码子的简并性和大肠杆菌的密码子喜好性原则,在不影响氨基酸序列的前提下,修改 3AB序列中的部分稀有密码子,将其分为 9条长引物,各长引物之间设计 12个互补序列,经重叠 PCR法得到 3AB基因。利用P3AB5’NdeI:5’-GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG - 3 ’和 P3AB3’SalI:5’ –ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3’,引入酶切位点 NdeI和 SalI。

2.2.2 重组表达质粒的构建

将合成的 3AB基因用 NdeⅠ、SalⅠ进行双酶切,胶回收纯化酶切产物。然后与同样经过 NdeⅠ、SalⅠ双酶切、纯化的表达载体 PET-28(a+)用 T4 DNA连接酶进行连接,构建重组表达质粒,转化到DH5α感受态,用 PCR筛选阳性克隆,经酶切鉴定后送天根测序,将经测序正确的重组质粒命名为PET-28-3AB。

2.2.3 重组质粒的表达

将测序正确的表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)感受态,挑取阳性单菌落到含卡那霉素的 LB培养基中,按 1:100接种于含 50μg/mL卡那霉素的LB培养基培养。当培养至 OD0.6～0.8时加入IPTG至终浓度为 1mmol/L,诱导表达 6h后收集菌体,取样用 12%SDS-PAGE观察分析结果。

2.2.4 表达蛋白的纯化、复性

将诱导表达后的菌体用超声破碎缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA PH8.0,1mg/mL溶菌酶)按 20mL/g菌体重悬沉淀,用超声破碎仪进行超声破碎,分别收集超声破碎上清和沉淀,取样进行 SDS-PAGE分析,观察目的蛋白表达情况。超声沉淀经包涵体洗涤液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,2mol/L Urea,2%Triton)洗涤后用包涵体变性缓冲液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,8mol/L Urea,100mmol/Lβ-巯基乙醇,2%Triton)重悬,4℃搅拌过夜。溶解后的包涵体用镍离子亲和层析柱进行纯化,纯化方法参照说明书进行。将纯化洗脱的蛋白用复性缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl PH8.0,50mmol/L NaCl,1%甘油)稀释 1倍后再用复性缓冲液至 4℃进行透析复性,每隔 6 h～8 h换液 1次,共透析 24 h,最后用超纯水或用 5mmol/L Tris-HCl PH8.0透析 2次。为提高蛋白浓度可以用蔗糖或 PEG20000进行浓缩,浓缩后的蛋白用紫外分光光度计测定蛋白含量,-80℃保存备用。

2.2.5 表达蛋白 EL ISA检测方法的建立

2.2.5.1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定

采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度和阴、阳性血清最佳稀释度。将纯化的重组抗原用 pH9.6的碳酸盐缓冲液自右向左依次倍比稀释为 2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L 4个浓度 ,每孔 100μL,4℃包被过夜。次日用 PBST洗涤 3遍,用 1%酪蛋白的 PBS作为封闭液,200μL/孔,37℃封闭 2 h。用稀释液将阴、阳性血清按 1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀释 ,每孔 100μL,37℃孵育1 h。洗涤后加入羊抗猪酶标二抗 (1:20000)100μL,37℃孵育 1 h。常规方法加入底物、终止液,至酶标仪测定 OD450。

2.2.5.2 羊抗猪 IgG-HRP最佳工作浓度的确定

根据 2.2.5.1确定的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度进行包被和稀释血清,羊抗猪 IgG-HRP分别以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀释,按常规方法进行 EL ISA操作 ,测 OD450。

2.2.5.3 封闭液的选择

按已确立的条件,分别用含 1%酪蛋白、0.5%酪蛋白、1%BSA、0.5%BSA和 2%蔗糖的 PBS作为封闭液封闭,进行 EL ISA方法检测,比较阳性血清和阴性血清的OD值比值 (P/N)以确定最适合的封闭液。

2.2.5.4 稀释液的选择

按上述已确立的条件,分别以含 0.5%酪蛋白、0.25%酪蛋白、0.5%BSA、0.25%BSA的 PBST作为稀释液稀释血清和二抗,按常规 EL ISA方法检测。

2.2.5.5 血清、二抗最佳作用时间的确定

按上述最佳稀释液将参考阴、阳性血清做最佳稀释 ,分别于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,羊抗猪 IgG-HRP按最佳稀释度作用 60 min固定不变,以确定最佳血清作用时间;同样将羊抗猪 IgGHRP按最佳稀释度稀释,分别于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,而固定阴、阳性血清作用时间 60 min不变,以确定最佳二抗作用时间。

2.2.5.6 最佳底物作用时间

根据上述已确立的条件,改变底物作用时间为5 min、10 min、15 min、20 min,比较各组阴、阳性血清的OD值和 P/N值,以确定最佳底物作用时间。

2.2.5.7 判定标准的确定

将已知 FMD 3AB抗体强阳性血清用已知 FMD 3AB阴性的健康仔猪血清进行系列稀释后,用 PR ION ICS公司的 FMDV 3ABC抗体阻断 EL ISA检测试剂盒检测。将检测结果OD值接近试剂盒强阳性对照和阴性对照的血清分别作为参考阳性血清和参考阴性血清,根据试剂盒判定标准,计算试剂盒阴、阳性临界值和强阳性与弱阳性临界值,并将接近该临界值的血清 OD值作为参考阴、阳性临界值和参考强阳性与弱阳性临界值血清。用已建立的 EL ISA方法测定参考阴、阳性血清、参考阴、阳性临界值和参考强阳性与弱阳性临界值血清 OD值。根据血清样品抗体效价 =(OD样品-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)来确定判定标准。以参考阴、阳性临界值血清平均 OD值作为待测样品 OD值,根据上述公式算得的效价为阴、阳性临界点;参考强阳性与弱阳性临界值血清平均 OD值作为待测样品 OD值,算得的效价为强阳性与弱阳性临界点。

2.2.6 特异性试验

用 FMDV疫苗免疫猪血清、猪瘟病毒 (HCV)、猪蓝耳病病毒 (PRRSV)和猪细小病病毒 (PPV)阳性血清 1∶100稀释,按已建立的 EL ISA方法进行检测,判断特异性。

2.2.7 重复性试验

选取 6份猪血清,阳性、阴性血清各 3份,每份重复 5孔,用已建立的 EL ISA方法进行检测,计算变异系数。

2.2.8 干燥方法及稳定性试验

选取阳性、阴性血清各 1份,每份重复 3孔,用同一批次包被的酶标板采用不同干燥方法,分别间隔 1个月、2个月、3个月进行 EL ISA检测,根据结果判定最佳干燥方法和稳定性。

2.2.9 符合率检验

对 56份猪血清分别用已建立的 EL ISA检测方法和进口 F MDV 3ABC抗体阻断 EL ISA检测试剂盒进行检测,根据结果计算二者的符合率。

3 结果

3.1 3AB基因的合成

根据重叠 PCR法获得的 3AB基因与预期长度(695bp)一致。

3.2 重组表达质粒的构建

重组质粒 PET-28-3AB经 NdeⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,得到了约 670bp的 3AB片段和约 5400bp的 PET-28a(+)空载体片段。以该质粒为模扳,扩增出约 670bp的目的片段。经测序结果分析,核酸序列和阅读框均正确。结果证实,重组质粒 PET-28-3AB构建成功。

3.3 重组表达蛋白的 SDS-PAGE电泳分析

PET-28-3AB重组菌在含有卡那霉素的 LB培养液中培养,待 OD值达到 0.8时,加入 1 mmol/L IPTG进行诱导表达 6 h,每隔 1 h取样一次。表达产物在 SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量约为 33 KD,且在诱导 6 h时蛋白的表达达到较高水平。经超声破碎上清液和沉淀的 SDSPAGE电泳分析,重组蛋白主要以包涵体的形式表达。包涵体经溶解后,用 Ni离子亲和层析柱进行纯化,纯化方法参照说明书进行。经纯化后的蛋白基本无杂带,纯度较高。蛋白复性后经紫外分光光度计测 OD280和 OD260,根据公式 C=1.45×OD280-0.74×OD260计算其浓度为 0.25g/L。

3.4 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释倍数的选择

方阵法结果 (表 1)显示:当抗原以 0.625mg/L包被,血清按 1:100稀释时,阳性血清 OD值接近1.0,阴性 OD值较低,且 P/N=8.876较大。因此选择 0.625mg/L作为最佳抗原包被浓度,血清最佳稀释度为 1:100。

表 1 最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度测定结果

3.5 酶标二抗最佳工作浓度的确定结果

根据 3.4确定的最佳抗原包被浓度和最佳血清稀释度进行包被和稀释血清,羊抗猪 IgG-HRP分别以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀释,结果显示,当羊抗猪 IgG-HRP按 1:25000稀释时,阳性血清 OD值接近 1.0,且 P/N最大,因此选择 1:25000作为酶标二抗最佳工作浓度。

3.6 最佳封闭液和稀释液的确定结果

按最佳抗原浓度包被,血清和二抗按照最佳稀释倍数稀释,用不同配方的封闭液 (包括含 1%BSA的 PBS、含 0.5%BSA的 PBS、含 1%酪蛋白的 PBS和含 0.5%酪蛋白的 PBS)和稀释液 (包括 PBST、含0.5%酪蛋白的 PBST、含 0.25%酪蛋白的 PBST和含 0.2%BSA的 PBST)进行 EL ISA操作,结果显示:当封闭液为含 0.5%酪蛋白的 PBS时,阳性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大;当稀释液为含 0.5%酪蛋白的 PBST时,P/N值最大。因此选择含 0.5%酪蛋白的 PBS作为最佳封闭液,含 0.5%酪蛋白的PBST作为最佳稀释液。

3.7 血清、二抗最佳作用时间的选择结果

按上述已确立的条件,分别改变血清和二抗作用时间为 30 min、45 min、60 min,变化其中一个作用时间,而固定另一个作用时间为 60 min不变,用已确立的 EL ISA条件进行检测。结果显示,当血清作用时间为 45 min时,阳性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大,因此选择 45 min作为血清最佳作用时间;二抗作用时间为 30 min时,P/N值最大,但二抗作用时间为 30 min时,阳性血清 OD值偏小,而 45 min时,阳性血清 OD值接近且大于 1.0,P/N值也较大,因此选择 45 min作为二抗最佳作用时间。

3.8 底物最佳显色时间的确定

按上述已确立的 EL ISA条件,改变底物作用时间为 5 min、10 min、15 min、20 min,根据阳性、阴性血清 P/N值,确定最佳底物作用时间。结果显示:底物作用时间为 10min时,P/N值最大,因此选择10 min作为最佳底物作用时间。

3.9 判定标准的确定

用已建立的 EL ISA方法测定参考阴、阳性血清,参考弱阳性临界值血清和参考强阳性与弱阳性临界值血清 OD值,重复 11孔,取平均值。结果显示,根据血清样品抗体效价 =(OD样品-OD阴性)/(OD阳性-OD阴性)来确定判定标准。根据公式计算得到样品效价小于 0.30判为阴性,介于 0.30与0.49之间判为弱阳性,大于 0.49判为强阳性。

3.10 特异性试验结果

按已确立的 EL ISA方法,用 FMDV疫苗免疫猪血清、HCV、PRRSV、PPV阳性血清进行交叉试验,结果按判定标准判定均为阴性。

3.11 重复性试验结果

用同一批重组 3AB蛋白包被的 EL ISA板对 6份样品进行检测,每份重复 5孔,结果显示,重复性试验变异系数的均值为 5.314,其中最大的为11.702,表明该方法具有良好的重复性。

3.12 干燥方法及稳定性试验结果

用同一批次包被的酶标板采用不同干燥方法(包括 37℃2 h、37℃4 h和真空抽干),分别间隔 1个月、2个月、3个月进行 EL ISA检测,结果显示,3种干燥方法中以真空抽干效果最好,随时间延长,OD值差异较小,且 P/N值较大,说明具有较好的稳定性。因此选择真空干燥作为最佳干燥方法。

3.13 临床检验结果

对 56份猪血清分别用已建立的 3AB-EL ISA检测方法和 PR I ON I CS公司的 FMDV 3ABC抗体阻断 EL ISA检测试剂盒进行检测,结果本研究建立的EL ISA检测结果有 3份强阳性、2份弱阳性,其余 51份为阴性,阳性率为 8.93%;PR I ON ICS公司的试剂盒检测结果为 3份强阳性、3份弱阳性,50份阴性,阳性率为 10.71%。二者符合率为 98.21%。

4 分析与讨论

(1)本研究将重组 FMDV非结构蛋白 3AB作为抗原进行包被,取代了传统的灭活病毒抗原,解决了生物安全问题,能够鉴别诊断自然感染动物和疫苗免疫动物。目前国内外开展了大量检测 FMDV NSP抗体方法的研究,并比较了不同非结构蛋白用于鉴别自然感染动物和疫苗免疫动物的效果。在FMDV的几种非结构蛋白中 3D是最早用于诊断的非结构蛋白,但后来从疫苗免疫动物的体内也检测到 3D的抗体[3,4],说明 3D蛋白不能区分自然感染动物和疫苗免疫动物。Mezencio等[5]测定了不同来源的动物血清 2C抗体,疫苗免疫动物为阴性而自然感染动物全为阳性,但猪和牛血清中的 2C抗体消退要比 3ABC早,而且疫苗免疫牛的血清偶尔也可检测到 2C的抗体。Bergmann等[6]比较了 3A、3B、2C、3D和 3ABC作为诊断抗原,应用间接 EL ISA试验检测感染牛的敏感性和准确性,以 3A、3B和3ABC为抗原检出的结果与病毒分离和电转移免疫印迹试验 (Electroimmuno transfer blot,EITB)的检出结果相一致,尤其是 3ABC效果最好。Silberstein等[7]用在大肠杆菌中表达的 3AB蛋白作检测抗原,结果表明,3AB可以作为区别自然感染与疫苗免疫的重要指标。目前认为非结构蛋白 3AB和 3ABC抗体是鉴别 FMDV自然感染动物与疫苗免疫动物的最可靠指标[4,8]。

(2)采用 RT-PCR直接获得的基因并不一定适合于原核系统的表达。为了实现 3AB基因在大肠杆菌中高效表达,本研究采用人工设计引物,用重叠 PCR方法合成基因。在保持 3AB基因所编码的氨基酸序列不变的前提下,我们修改了部分稀有密码子,使得重组的 3AB基因在大肠杆菌中获得高效表达。

(3)本研究采用 PET-28a+作为表达载体,载体上带有的 6×His标签在蛋白纯化时可以利用镍离子亲和层析法获得纯度较高的蛋白,这种方法是目前纯化目的蛋白常用的方法,具有快速、高效的优点。本研究采用大肠杆菌表达获得较纯的重组蛋白,但仍不可避免含有少量表达载体的抗原,而受检动物血清中通常含有大肠杆菌抗体,会造成非特异性反应。本试验采用 0.5%的酪蛋白作为封闭液和血清稀释液,可有效降低本底,减少非特异性反应。国外相关研究称可通过在样品稀释液中加入大肠杆菌提取物来消除非特异性反应[9]。

(4)EL ISA检测方法的建立,其判定标准是关键。对于间接 EL ISA方法,其判定标准一般有两种,一种是根据测定样本的原始 OD值和标准差来确定临界值;另一种是计算待测样品的抗体效价,即待测样品相对于阳性对照的比值,通过大量测定样本效价及标准差来确定临界值和可疑值。本研究在确定判定标准时是将已知 FMDV 3AB抗体阳性猪血清用已知阴性猪血清依次稀释,用 PR I ON ICS公司的 FMDV 3ABC抗体阻断 EL ISA试剂盒进行检测,根据试剂盒判定标准,选择阴阳性临界值及强阳性与弱阳性临界值,并以此临界值血清,用已建立的 EL ISA方法重复测定多次取平均值,计算其抗体效价,并以此作为判定标准。

(5)目前检测口蹄疫 NS蛋白抗体的研究大多数是采用单个 NS蛋白,由于同时检测多个 NS蛋白抗体比检测单一蛋白抗体更能清楚地进行鉴别诊断,可以通过同时检测血清中 1个以上的 NS蛋白抗体以提高检测的准确性。在原核表达系统中,大多数NS蛋白都能以融合蛋白的形式表达,且很多情况下以包涵体形式表达,真核生物的表达系统与原核表达系统相比有其优点,如表达蛋白的糖基化和表达产物不含能产生非特异性反应的细菌蛋白。Sorensen等[9]报道了利用杆状病毒表达的 3ABC产物建立阻断 EL ISA用于区分 FMDV自然感染动物和疫苗免疫动物具有较好的敏感性和特异性,因此可以采用真核表达系统消除原核表达系统中非特异性反应的影响。

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