国境口岸结核病检测的生物安全风险与防护

陆琳 刘来福 刘国传 饶红 张绍福

(北京出入境检验检疫局 北京 100026)

1 前言

结核病一直是我国各口岸检验检疫机构实施卫生检疫的重点疾病,在出入境人员或移民体检中进行肺结核筛查也是全球结核病防控重点工作之一。今年新修改的《中华人民共和国国境卫生检疫法实施细则》中规定,传染性肺结核病是出入境人员监测传染病之一,世界卫生组织呼吁对出入境人员或移民进行肺结核筛查和病人分类管理,不少国家也要求我国的出境人群必需出具结核病的检测报告。为了控制结核病经国境口岸的传播,各直属出入境检验检疫局国际旅行卫生保健中心相继建立结核病检测实验室,对出入境人员及移民进行结核病的实验室诊断[1-2]。

结核分枝杆菌在卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中被列为第二类病原微生物 (危害程度为Ⅲ级),属高致病性病原微生物[3]。结核分枝杆菌有多种传播途径,以呼吸道吸入带菌的飞沫及带菌的尘埃为主要传播途径,也是引起实验室感染的最主要因素。据统计,从事实验的工作人员感染结核分枝杆菌的概率是其他行业工作人员的 3-9倍,结核分枝杆菌引起的实验室获得性感染可发生于实验室工作人员操作的整个过程中,尤其以在操作过程中产生的结核分枝杆菌的气溶胶危害最大[4]。

根据《人间传染的病原微生物名录》的规定,涉及结核杆菌的大量培养、结核杆菌离心和冻干等可产生气溶胶的实验操作及结核杆菌活菌感染的动物实验,应在 BSL-3或 ABSL-3实验室进行。临床样本的结核杆菌分离培养、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动可在 BSL-2实验室进行。对经有效方法灭活后不含结核杆菌活菌材料的分子生物学、免疫学等实验可在 BSL-1实验室进行[5]。国境口岸结核病检测主要是对结核分枝杆菌临床样本的操作,可在 BSL-2实验室进行。

目前,对于结核病检测实验室的实验活动制定的检测方法大都从检测技术本身进行了规范,但未对实验活动的生物安全要求进行规范。加强结核病检测的生物安全操作规范研究,对于降低实验室生物安全风险,确保实验室人员生命健康、检测结果的准确性,保障社会公共卫生安全和环境安全等方面具有重要意义[6]。

2 结核病检测易产生生物安全风险的关键环节及防护措施

2.1 实验样品的接收与开启

风险:由临床获取的结核杆菌培养物或冻干菌种在运输过程中可能会因试管塞子脱落或破碎;冻干菌种多为真空封口,当打开冻干物的安瓿时,因为其内部可能处于负压,瞬间进入的空气可能使一些菌体产生气溶胶扩散进入空气而造成污染。

防护措施:要求接受和打开样品的人员应当了解样品对身体健康的潜在危害,接受常规预防措施的培训;样品要在生物安全柜内打开,缓慢向安瓿中加入液体以重悬冻干物,避免出现泡沫;准备好消毒剂。

2.2 试验样品涂片

风险:用于显微观察的培养物、血液、唾液和粪便等样品在固定和染色时可能产生气溶胶;样品的热固定不能杀灭所有涂片标本中的结核杆菌;若涂片长时间暴露在高温中可使残留活菌减少,并仅见于涂片厚的部分,从而提示在热固定时,痰液对细菌有保护作用。

防护措施:涂片操作过程应避免产生气溶胶,制成涂片后立即染色可减少危险;若涂片不能及时染色,建议将涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法处理以确保安全;涂片应当用镊子拿取,恰当储存,并经消除污染或高压灭菌后再丢弃。

2.3 结核杆菌接种培养

风险:在结核杆菌传代、耐药检测、生化分型实验以及感染动物结核杆菌再分离试验中均要求进行结核杆菌接种培养,在此活动中试管开封、样品转移、吸管吹吸、混合等步骤可能产生气溶胶;在菌体转移过程中,培养物制剂的溅出、泼洒和容器的破碎等也可造成严重污染。

防护措施:在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸,使用后将其高压灭菌或按感染性废物处理;微生物接种环的直径应为 2～3mm并完全封闭,手柄的长度应小于 6cm以减小振动,或者采用一次性灭菌棉签;用封闭式微型电加热器消毒接种环能够避免在明火上加热所引起的感染性物质爆溅;最好使用不需要进行消毒的一次性接种环。

2.4 实验样品研磨

风险:使用匀浆器时容器内会产生气溶胶;玻璃可能破碎而释放感染性物质。

防护措施:要求接受和打开样品的人员应当了解样品对身体健康的潜在危害,接受常规预防措施的培训;样品要在生物安全柜内打开。

2.5 未经灭活组织标本采集

风险:含活菌血清与细胞样品可能造成污染;带活菌的玻璃器皿破损、注射器的误伤而造成血液传播;样品的稀释混匀可能产生气溶胶。

防护措施:样品稀释在生物安全柜内进行;尽可能采用塑料器皿,注射器使用时针头必须牢牢固定在注射器上;从带有橡皮塞瓶中抽取微生物悬液时,应该用消毒棉球将瓶口与针头围住,以防气溶胶逸出。

2.6 室内空气、实验用品以及操作台面污染

风险:微生物操作过程对室内空气、用品以及操作台面污染。

防护措施:试验结束后立即开启紫外灯对操作区和实验室进行照射消毒 2h以上;每次试验操作终止后,必须清理好实验台,所有物品归位并用 75%乙醇溶液或 3-5%石碳酸擦洗实验台和地面。

2.7 菌种以及培养物保藏

风险:手污染造成感染性物质的食入;与皮肤和眼睛的接触感染;原始记录未消毒造成污染;个人防护装备未彻底消毒而造成污染。

防护措施:实验室人员在操作时应戴一次性手套,并避免接触口、眼及面部;实验结束后,操作人员要仔细的用肥皂和清水将双手洗净;在任何可能导致潜在传染性物质溅出的操作过程中,应采取防护措施保护面部、口和眼。

3 结核病检测的生物安全操作

3.1 标本容器

标本容器应是玻璃和塑料制品,坚固,加盖或加塞盖好后应无泄漏;容器上应粘贴标签以便于识别,外部不应有残留物;标本的要求和说明书不应卷在容器外面,应该分开放在防水的袋子里;痰标本采用世界卫生组织 (WHO)推荐的国际通用螺旋盖痰瓶或可密封塑料盒、蜡纸盒收集 (参考规格:直径 4cm,高度 2cm)。

3.2 样本采集

应遵循专业防护方法,所有操作均应戴手套、口罩;应由受过专业培训的人员采集病人的样本;由于当患者咳嗽、咳痰时,易产生含有结核菌的气溶胶,感染周边人群的几率较高,故采集痰标本时应在远离人群的开放空间,或通风良好的室内进行;在静脉抽血时,应使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器,使血液直接采集到带塞的运输管和 (或)培养管中,用完后自动废弃针头。

3.3 标本接收

接收标本的实验室应安排专门的标本接收通道;通道内应安装紫外灯,备有消毒剂。

3.4 打开包装

接收和打开标本的人员应了解标本对身体健康的潜在危害,并接受过专业防护的培训;标本的内层容器应在生物安全柜内打开,并准备好消毒剂。

3.5 打开标本管和取样

应在生物安全柜内打开标本管;应戴手套,并对眼睛和粘膜进行保护 (护目镜或面罩)。

3.6 样品涂片

涂片操作过程应避免产生气溶胶,制成涂片后立即染色可减少危险;若涂片不能及时染色,建议将涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法处理以确保安全;涂片应当用镊子拿取,恰当储存,并经消除污染或高压灭菌后再丢弃。

3.7 避免吸入或接触感染性物质

实验室人员在操作时应戴一次性手套,并避免接触口、眼及面部;严禁在实验室内饮食以及储存食品和饮料;在实验室,工作人员嘴里不应有任何东西 (笔、口香糖);不应在实验室化妆和装卸角膜接触镜。

3.8 避免感染性物质的注入

应避免被破损玻璃器皿刺伤所引起的接种感染;尽量以塑料器皿和吸管代替玻璃器皿和吸管;锐器损伤时 (如通过皮下注射针头、玻璃吸管及破碎的玻璃),应防止意外注入感染性物质;减少使用注射器和针头,如可用简单工具打开瓶塞,然后用吸管取样;一次性物品应丢弃在专用的防/耐穿透的带盖容器中。

3.9 防止感染性物质的扩散

微生物接种环的直径为 2～3mm,并完全封闭,柄的长度不应超过 6cm,以最大限度的减小抖动,防止被接种物洒落;被处理的废弃标本和培养物,应放置在防漏的容器内 (实验室废弃物袋),在丢弃到废弃物盛器中前,采用高压灭菌胶带将顶部固定好,然后进行高压灭菌;工作结束后,应采用适当的消毒剂清除工作区的污染。

3.10 标本的传递与运输

标本在设施内的传递应符合下列要求:

(1)装有标本的容器应保持直立,避免意外泄露或溢出;

(2)容器应是金属或塑料制品,能耐高压灭菌 /化学消毒剂的作用;

(3)应定期清除污染。

4 结核病检测主要生物安全仪器设备的选用、使用和维护

4.1 生物安全柜的选用、使用和维护

4.1.1 选用

生物安全柜是在操作原代培养物、菌毒种及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者、实验室环境及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的安全设备。国境口岸结核病检测主要是对结核分枝杆菌的临床样本进行操作,根据其生物安全风险,从保护人员和实验对象的角度考虑,建议选用Ⅱ级生物安全柜 (即气溶胶经 HEPA过滤器过滤后,一部分排放出去,一部分再次循环进入安全柜内,其中:前部开口区的吸入气流用以保护操作者的安全,经 HEPA过滤的垂直气流用以保护样本,排出的气流经 HEPA过滤是为了保护环境),尤其不能使用超净工作台来代替生物安全柜。

4.1.2 使用

(1)生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。

(2)生物安全柜内应少放置器材或标本,以免影响后部压力排风系统的气流循环。

(3)生物安全柜内不应使用本生灯,防止燃烧产生的热量干扰气流,损坏过滤器;应使用微型电加热器。

(4)所有工作应在工作台面的中后部进行,并能通过玻璃观察挡板观察。

(5)操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。

(6)工作完成后及下班前,应用消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。

(7)工作开始前和结束后,安全柜的风机应运行 10 min以上。

(8)所有进入和移出该系统的物品应通过连接的消毒设备进行消毒。

4.1.3 维护

应定期用 70%医用酒精擦拭消毒安全柜的内壁和台面,保持清洁;当生物安全柜被污染后,可用甲醛、过氧化氢熏蒸法消毒;每年需要检查和更换消毒用紫外灯;每年应更换一次 HEPA过滤器;定期对生物安全柜进行检测或检定。

4.2 高压灭菌器的选用、使用和维护

4.2.1 选用

因为结核病检测实验室涉及高致病性病原微生物操作,因此实验室对实验器械、试剂以及废弃物必须进行高压灭菌。目前使用比较普遍的高压灭菌器是高压蒸汽灭菌器,具有温度高、热穿透力强,灭菌效果好等特点[7]。

4.2.2 使用

(1)高压灭菌器属于一类压力容器,是涉及生命安全、危险性较大的特种设备之一,国家早已颁布了有关的法规标准,操作人员应定期参加专门的技术培训,做到持证上岗。

(2)在使用高压灭菌器时严禁超温超压运行,应缓慢地加载和卸载,做到“四慢一稳”,即慢升温慢升压慢降压慢降温,恒温操作时工艺参数稳定。

(3)严禁带压操作,并注意装载容量,下排气灭菌器的装载量不得超过压力容器内容量的 80%,预真空灭菌器的装载量不得超过 90%且不能小于容器内容量的 10%,以防止“小装量效应”。

4.2.3 维护

按照国家质量技术监督主管部门规定,必须定期对高压灭菌器进行定期检验,包括外部检验、内部检验和耐压试验。

4.3 离心机的选用、使用和维护

4.3.1 选用

离心机是借离心力分散液相非均一体系的设备,它根据物质的沉降系数、质量、密度等的不同,应用强大的离心力使物质分散、浓缩和提纯。结核病检测实验室应尽可能选用配备密封吊桶、转子的生物安全型离心机。

4.3.2 使用

(1)离心机应当放在低于使用者能看到离心腔的平均高度位置,以便能够准确的安装转头和离心吊桶。

(2)离心管和盛放离心标本的容器应由厚壁玻璃 (塑料)制品制成,并且在使用前应检查是否破损,使用时应用螺旋盖牢固盖紧。

(3)离心桶的装载、平衡、密封和打开应在生物安全柜内进行。

(4)离心桶和十字轴应按质量配对,并在装载离心管后正确平衡。

(5)当使用固定角离心转子时,离心管不能装得过满,以防漏液。

4.3.3 维护

应在使用前检查离心机内转子部位的腔壁有无被污染。应检查离心转子和离心桶无腐蚀和细微裂痕。每次使用后,应清除离心桶、转子和离心机腔的污染,应将离心桶倒置存放使平衡液流干。应定期清理离心管座,定期清洗离心杯,并用消毒剂清除污染。

[1] Global Tuberculosis Control:A short update to the 2009 report WHO,2009.

[2] Castro C,González L,Rozo JC,et al.Biosafety evaluation of the DNA extraction protocol for Mycobacterium tuberculosis complex species[J].Biomedica,2009,,29(4):561.

[3] 刘国传,刘来福,张利峰,等.检验检疫病原微生物实验室的生物安全[J].检验检疫学刊,,2009,3:20.

[4] 张利峰,刘来福,饶红,等.检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求的分析研究[J].检验检疫学刊,2009,5:12.

[5] 马虹,杨修军,隋达伟,等.病原微生物实验室的生物安全管理[J].中国卫生工程学,2010,2:32.

[6] 刘来福主编.病原微生物实验室生物安全管理和操作指南[M].北京:中国标准出版社,2010.

[7] 王君玮,王志亮,吕京.二级生物安全实验室建设与运行控制指南[M].北京:中国农业出版社,2009.