新疆牛源豕链球菌的部分生物学特性

陈明辉,王开胜

(1新疆兵团农九师畜牧兽医站,额敏 834601;2石河子大学科技处,石河子832003)

豕链球菌(Streptococcus porcinus),链球菌属的一个种,链球菌属细菌属共有30多个种,兰氏分类法利用其群特异性抗原,将链球菌属细菌分为20多个血清型。链球菌属细菌不同种之间的致病性存在着较大差异。豕链球菌主要感染猪[1],也有感染人的报道[2],会导致猪喉部脓肿,败血症,而且在肺炎病例中有时也会分离出这种病菌。但我国医学和动物医学领域均未见关于该菌感染的报道。

新疆塔城某农场本地成年牛发生了一种以流涎,狂躁或低头呆立,视力障碍,咽喉水肿,脑膜出血为特征的疾病,整个病程中死亡11头,我们对送检频死期扑杀的病牛脑组织、心血、肝、淋巴结及脾脏进行了病原的分离、培养和APISTREP20的生化鉴定,采用平板法观察了细菌绵羊血和兔血的溶血情况,采用链球菌乳胶凝集诊断试剂对两株分离株进行了兰氏血清学分型鉴定,根据NCSL标准对常见的抗生素进行了药敏实验,并分3个组进行了实验动物的感染实验,以期为今后的鉴定诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

培养基:LB绵羊血平板,链球菌选择血平板,亚碲酸钾血平板以及各种鉴定培养基均按常规方法配制;APISTREP20生化鉴定试剂购自法国梅里埃公司产品。

链球菌乳胶凝集分型诊断试剂盒(购自法国梅里埃公司产品)。

药敏实验用抗生素:青霉素、氨苄西林、头孢噻肟钠、四环素、红霉素、盐酸林可霉素、氯霉素。

1.2 方法

1.2.1 病料的分离、培养

无菌采取病料的脑、心血、肝、脾、淋巴,分别接种于LB血清肉汤中,分别置于10%CO2和需氧37℃培养24h;将病料分别涂片,并用瑞士和姬姆萨染色,镜检、观察。

1.2.2 分离菌的形态及菌落特性

将初代培养物接种于LB绵羊血平板,链球菌选择血平板,亚碲酸钾血平板观察菌落特征;对肉汤和平板培养物进行革兰氏染色,观察菌体形态。

1.2.3 分离菌的培养及生化特性

分离株经24hLB血清肉汤培养后,分别接种于LB血清肉汤中(培养液成分中分别含2%NaCl、6.5%NaCl;调节培养液的pH为9.6)培养,观察其对高盐、高碱的耐受性,另外接种于LB血清肉汤中,分别置于10℃、40℃,观察其对低温、高温的耐受性。

分离菌经24hLB绵羊血平板纯培养后,挑取单个菌落,分别按照说明书进行APISTREP20(法国梅里埃公司产品)进行生化反应。

1.2.4 分离菌的药物敏感性

采用用药敏纸片法来检测对抗生素药物的敏感性。

方法:将分离株分别接种Mueller-Hinton肉汤(5%绵羊血),37℃18～24h。用灭菌的棉拭子蘸取上述摇匀的肉汤培养物,均匀地涂布到直径90mm的Mueller-Hinton琼脂(5%绵羊血)表面,最后沿平板内缘涂布1周,每一菌株涂2块血平板。经室温干燥3～5min,用无菌镊子将药敏纸片紧贴于平板表面(每块平板贴6种药敏纸片),纸片与平板内缘相距约8mm。37℃18～24h后记录结果。判定标准:参照美国实验室标准委员会(NCLS)药敏试验纸片扩散法法规。

1.2.5 分离菌的血清学特性

采用链球菌乳胶凝集分型诊断试剂盒(Streptococcusgroupingkit)。取经过生化鉴定后菌株的24hLB培养物,分别与试剂盒兰氏分群A～G的乳胶诊断试剂做凝集试验(按照说明书的方法进行),并且设空白和阳性对照。

1.2.6 分离菌的溶血特性

采用平板法(plateassay,PA)测定分离株的溶血特性。将链球菌接种于5%兔鲜血LB平板和5%绵羊鲜血LB平板,37oC培养48h后观察溶血情况,菌落周围出现溶血圈者判为溶血阳性。

1.2.7 分离菌的动物感染实验

实验组一。取病牛淋巴结,脑组织无菌研磨,制成1∶4的悬液,蔡氏滤器过滤后,取0.2mL滤液腹腔接种于4只小白鼠(昆明系),取1mL滤液静脉接种于2只实验家兔,全部设立生理盐水对照(2只小白鼠、1只家兔),观察结果。

实验组二。取病牛淋巴结,脑组织无菌研磨,制成1∶4的悬液,直接取0.2mL悬液腹腔接种于4只小白鼠(昆明系),直接取1mL悬液静脉接种于2只实验家兔,全部设立生理盐水对照(2只小白鼠,1只家兔),观察结果。

实验组三。将分离株培养于血清马丁肉汤24h后,腹腔接种小白鼠(4只)0.2mL(麦氏比浊,含0.5亿细菌),家兔(2只)耳缘静脉接种1mL(麦氏比浊,含2.5亿个细菌),全部设立生理盐水对照,观察。

实验动物家兔及小白鼠均由石河子大学实验动物中心提供,均为清洁级,实验场所为二级生物安全实验室。

2 结果与分析

2.1 分离株的形态及菌落的特性

病料(脑组织和淋巴结)涂片、瑞氏或姬姆萨染色均可看到小点状的双球菌,成对排列,并可在菌体周围形成明显的荚膜;肉汤底部可见少量絮状沉淀,经革兰氏染色可见呈链状排列的革兰氏阳性球菌;该菌在链球菌选择绵羊血平板上能形成针尖大、透明、圆形的β-溶血型小菌落;亚碲酸钾绵羊血平板上能形成淡灰色、细小、光滑的β-溶血型小菌落。

2.2 培养特性、生化特性及溶血特征

API-20生化反应结果(表1)与豕链球菌的生化反应结果符合率为98%。

分离株在10℃低温和40℃的高温中可以正常生长,对高温和低温有耐受性;分离株在pH9.6的培养条件下不能生长。

2株分离株在绵羊血和兔血中均为β-溶血。

表1 分离株的API-20链球菌系统检测结果表Tab.1 The API-20 Strep system results of the strains

2.3 药物敏感实验

分离株除对青霉素和四环素有耐药性外,对其余的抗生素均敏感。

2.4 分离株的血清分型

Lancefield分群鉴定结果显示,2株分离株均为兰氏B型(表2)。

表2 分离株的乳胶凝集诊断分型试验结果Tab.2 Lancefield Streptococcus grouping kit results of the strains

2.5 动物实验

实验组一。即病料经蔡氏滤器处理后接种小白鼠和家兔组,接种2周内均未见小白鼠和家兔有任何异常反应,家兔测量体温亦正常,2周后扑杀剖检观察,未见任何异常病变,对照组亦正常。

实验组二。即脑组织、淋巴组织研磨物接种小白鼠和家兔组,4只小白鼠在接种后分别在12h、17h、20h、26h,开始出现精神萎靡不振样,缩作一团,被毛逆立,72h内均未见死亡,72h后全部经眼球放血致死后可从肝、脾、淋巴结和脑中分离出与病料分离株具有相同生物学特性的细菌。对照组正常。

家兔在接种后18h即出现发热症候群,精神萎靡,食欲不佳,72h内未见死亡,72h后安乐死,可从肝、脾、淋巴结和脑组织中分离出与病料分离株具有相同生物学特性的细菌。对照组正常。

实验三。即纯培养物接种的4只小白鼠24～36h均死亡,亦能分离到与接种菌相同生物学特性的细菌。对照组正常。

家兔接种初体温升高,未见死亡,72h后致死,也有相同的结果。对照组正常。

3 讨论

本研究结果表明,从病死牛脑组织及淋巴结分离的两株链球菌其形态血特性,菌落特性、培养特性、生化特性鉴定结果稳定且相同,符合豕链球菌特征。

国际上,豕链球菌感染的报道和研究主要侧重于人和猪[3],可引起猪流产并并发肺炎[4～5]。而从未见有关于牛的报道。

国际上链球菌属细菌分类中常采用的方法为兰氏分型法,本研究中采用链球菌乳胶凝集分型试剂对分离株进行了分型鉴定,结果为兰氏B型,血清学分类上豕链球菌主要为 E、U、V、P等型[6～7]以及医学中多见的B型[8]。

动物感染实验(蔡氏滤器过滤组)基本可以排除病毒感染的可能性,病料和细菌的动物回归实验结果符合柯赫法则,表明分离株有一定的致病性。

溶血性是链球菌属细菌毒力的一个重要标志,分离株均对绵羊血和兔血产生了β-溶血,表明分离株具有一定的毒力。

根据目前的资料,我国还没有任何关于动物和人的豕链球菌的任何报道,所以对此病菌应给予足够的重视。

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