耐力训练下调的HDMCP表达对非酒精性脂肪肝线粒体活性氧生成的影响

刘艳环，马国栋

●研究报道Short Comunications

耐力训练下调的HDMCP表达对非酒精性脂肪肝线粒体活性氧生成的影响

刘艳环，马国栋

目的：研究耐力训练对非酒精性脂肪肝HDMCP表达的影响及与活性氧生成的关系。方法：以西方膳食诱导的脂肪肝小鼠为模型，跑台运动为训练手段，测定肝脏HDMCP及MnSOD表达，顺乌头酸酶和MnSOD活性，MDA、OH·-含量的变化。结果：非酒精性脂肪肝小鼠模型组肝脏MnSOD与HDMCP表达显著升高，顺乌头酸酶活性显著下降，MnSOD活性显著升高，MDA和OH·-含量显著升高；耐力训练后MnSOD表达进一步升高，而HDMCP表达显著降低，顺乌头酸酶活性得到明显恢复，MDA和OH·-含量显著降低，MnSOD活性进一步升高。结论：HDMCP在非酒精性脂肪肝发病过程中可能作为一种应激蛋白，调控线粒体活性的生成，但其调控作用不能够完全代替抗氧化系统的作用，只是起辅助作用，抗氧化系统才是真正的抗氧化主体；耐力训练后，抗氧化系统能力进一步增强，HDMCP表达降低，从而提高线粒体偶联程度，增强线粒体ATP合成能力。

耐力训练；非酒精性脂肪肝；活性氧；肝细胞癌下调的线粒体转运蛋白

耐力训练对非酒精性脂肪肝（NAFLD）有良好的预防/与治疗作用[1]，但其机理尚未完全清楚。线粒体作为细胞能量和活性氧产生的中心，与非酒精性脂肪肝发病关系密切。细胞ATP的产生与活性氧形成之间的平衡是维持细胞功能的重要保证。在非酒精性脂肪肝发病过程中，线粒体产生大量的活性氧，对细胞造成氧化损伤。为尽量避免这种氧化损伤，细胞会发生一系列的适应性反应，如细胞内抗氧化酶的改变[2]。除了抗氧化酶的改变外，早期认为解偶联蛋白2（UCP2）也发挥着重要作用，通过解偶联的方式减少线粒体活性氧的生成。但有一些研究发现在NAFLD的动物和细胞模型中UCP2得到了表达，但其仅仅是mRNA的表达，而未检测到蛋白质的存在[3]。最近的研究也表明在UCP2基因敲除鼠和正常鼠之间，其脂肪肝病变程度未见显著性差异[4]。因此，肝细胞癌下调的线粒体转运蛋白（HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein，HDMCP）的发现可能为此带来了曙光。Tan MG等[5]在肝细胞癌中克隆出一个新的基因，其蛋白命名为肝细胞癌下调的线粒体转运蛋白，他们还发现，HDMCP过度表达能够明显引起线粒体质子漏加强，膜电位降低，导致细胞内ATP含量显著降低，因此作者认为，HDMCP具有解偶联的功能，是一种新的解偶联蛋白质。

非酒精性脂肪肝发病过程中线粒体活性氧的产生是导致肝脏进一步恶化的重要原因。那么HDMCP与线粒体活性氧产生关系如何？耐力训练对HDMCP表达有何影响？这种表达的变化对线粒体活性氧产生如何？这方面尚未发现报道。因此本研究以西方膳食诱导的非酒精性脂肪肝模型，探讨耐力训练对非酒精性脂肪肝肝脏HDMCP表达的影响及与非酒精性脂肪肝关系进行研究，以期为耐力训练预防非酒精性脂肪肝的机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

雄性8周龄ApoE基因敲除小鼠（C57BL/6J）48只，体重20～22 g，购自北京大学医科部实验动物中心。实验动物随机分为4组，每组12只：（1）普通膳食14周对照组（C）；（2）14周西方膳食组（模型组M）；（3）继续西方膳食＋12周跑台运动组（ME）；（4）继续西方膳食12周组（MM）。西方膳食为（21%脂肪，0．15%胆固醇）[6]。跑台运动方案：0°坡度，小鼠第1～2周由10m/min，30m in，逐渐增加至13m/min，60min，自第3周开始为13m/ m in，60min，共运动12周。每天上午9:00至10:00进行运动，每周5次。每一组在实验结束，禁食12 h处死，取肝脏，部分用于测定线粒体呼吸，部分－70℃保存，用于测定基因表达。每天光照均为12 h，自由饮水。

1.2 肝脏线粒体的提取

断头处死迅速取出肝脏约2 g，用冷生理盐水冲洗净血污，剔除结缔组织、剪碎，加10 mL预冷生理盐水，电动匀浆1 150转/min，上下一次。0～4℃离心，600 g离心10m in。弃沉淀，上清于10 000 g离心10 min。沉淀用5 mL预冷生理盐水悬浮，Teflon手动匀浆器匀浆。加入5mL冷生理盐水中。10 000 g离心10min。沉淀悬浮在约2mL冷生理盐水中。

1.3 指标测定

1.3.1 肝脏细胞脂肪变程度的光镜观察每一阶段实验动物处死后，取肝脏并浸入生理盐水中洗掉血污，立即放入液氮冷却，然后放入-70℃恒温冰箱保存，以备光镜观察。光镜观察采用冰冻切片，H．E染色，光镜下观察脂肪病变程度。

1.3.2 肝脏线粒体顺乌头酸酶活性、MDA、羟自由基（OH·-）和MnSOD活性测定按文献[7]方法，测定顺乌头酸酶活性；根据过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，测定MDA含量；二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可进行比色测定谷光甘肽含量；根据Fenton反应，给予电子受体，用gress试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH·-成正比，从而计算出OH·-的含量。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生O2-·，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，根据抑制率的高低计算出Mn-SOD活性。

1.3.3 肝脏HDMCP与M nSODm RNA的表达以上述的肝脏组织，用Trizol Reagent试剂盒（Mrcgene产品）抽提总RNA，总RNA定性定量检测后用逆转录试剂盒（Ferment产品）参照说明书进行逆转录反应，以备用于HDMCP、UCP2的扩增。引物序列为[8]：HDMCP上游5'-GCCACTCCTTTGCCACCTAC-3'，下游：5'-CACAGCCTCATAAGCCACGA-3';MnSOD:上游：5'-GCACATTAACGCGCAGATCA-3'下游：5'-AGCCTCCAGCA ACTCTCCTT-3';β-actin上游：5'-TTGTAACCAACTGGGA CGAT-3'，下游：5'-TAATGTCACGCACGATTTCC-3'。由北京博雅生物有限公司合成。

用半定量法测定HDMCP和UCP2mRNA，反应参数为：95℃预变性5min，然后进行如下5个循环，94℃30 s，45℃45 s 72℃45 s，然后进行25个循环，变性温度与延伸温度不变，终末延伸72℃7min，退火温度分别为：53℃，55．5℃和56．5℃。

1.4 统计与分析

通过SPSS统计软件（SPSS11．5 for Windows）处理，计算均值和标准差（）。采用方差分析进行比较。显著性定为：P＜0．05。

2 结果

2.1 光镜观察肝脏脂肪肝病变程度

小鼠在经过14周西方膳食后，肝脏组织中出现了明显的脂肪滴，说明脂肪肝模型已经建立成功（见图1），26周组脂肪滴明显（见图2）；耐力训练组脂肪滴明显减少（见图3）；对照组未见明显的脂肪滴（见图4）。

图1 14周西方膳食后肝脏光镜照片（×100倍），可见明显的脂肪小泡。Figure 1 14week western dietgroup（×100）

图2 26周西方膳食后肝脏光镜照片（×100倍），脂肪小泡明显。Figure 2 26 week western diet group（×100）

图3 运动组肝脏光镜照片（× 100倍），脂肪小泡明显减少。Figure 3 Endurance trainingg roup（×100）

图4 对照组（×100倍），未见明显的脂肪小泡。Figure 4 Control（×100）

2.2 肝脏线粒体顺乌头酸酶活性、MnSOD酶活性及MDA和羟自由基（OH·-）含量

与C组比较，M、MM、ME组顺乌头酸酶活性均显著降低；MDA水平M和MM组均显著升高，与ME组未见显著性改变；OH．-水平M与MM组显著升高，ME组显著下降；MnSOD酶活性M、MM和ME组均显著升高。与M组比较，顺MM组乌头酸酶活性显著下降，ME组显著升高；MDA水平MM组显著升高，ME组显著下降；OH·-水平MM组显著升高，ME组显著下降；MnSOD酶活性MM组未见显著性改变，ME组显著升高。与MM组比较，顺ME组乌头酸酶活性显著升高；MDA水平ME组显著下降；OH．-水平ME组显著下降；MnSOD酶活性ME组显著升高（见表1）。

2.3 肝脏MnSOD和HDMCPm RNA的表达

与C组比较，M、MM和ME组MnSOD与HDMCPmRNA表达均显著升高；与M组比较，MM组MnSOD与HDMCPmRNA表达均无显著性改变，ME组MnSOD显著升高，而HDMCP显著下降；与MM组比较，ME组MnSOD表达显著升高，而HDMCP显著下降（见表2）。

表1 耐力训练对肝脏线粒体顺乌头酸酶活性、MnSOD活性与MDA和OH·-含量的影响Table 1 The effec ts of endurance training on aconitase activity，MnSOD activity and the contents ofMDA and OH·-

表2 耐力训练对肝脏MnSOD和HDMCPmRNA表达的影响Table 2 The effects ofendurance training on MnSOD and HDMCPm RNA expression

3 讨论

非酒精性脂肪肝形成与肝脏细胞中脂肪摄入与氧化平衡打破有关，当大量脂肪在肝脏细胞中积累时，增加了甘油三酯合成，从而降低了脂肪酸的氧化和甘油三酯的分泌，导致大量脂肪在肝脏细胞中积累，形成脂肪肝。线粒体是细胞的产能中心，为机体提供大约90%的ATP，但它同时也是细胞中O2·-的主要来源，细胞95%以上O2·-产生于线粒体[3]。线粒体异常是导致脂肪在肝脏细胞中积累的主要原因（所谓“第一次打击”），而线粒体异常导致的活性氧生成增加，进一步引起脂质过氧化（所谓“第二次打击”）[9]。线粒体呼吸链异常直接导致活性氧的产生[10]，ob/ ob小鼠肝脏线粒体活性氧生成的速率显著高于正常鼠[11]，活性氧引起的mtDNA缺失会显著地降低线粒体的数量和功能，从而导致肝脏脂肪病变和肝脏损伤[12]。这种损伤还会导致线粒体复合体I、III、IV和V合成受损，因为mtDNA编码13种线粒体复合体多肽。在非酒精性脂肪肝患者种发现氧化损伤的存在[13]。在ob/ob小鼠中发现线粒体呼吸链活性降低，而当用MnTBAP（一种MnSOD类似物）处理肥胖鼠时，线粒体呼吸链复合体活性增加，其活性可以增加30%～50%[14]。因此，活性氧与非酒精性脂肪肝关系重大。本研究发现在模型组MDA、OH·-均显著升高，而顺乌头酸酶活性显著降低，顺乌头酸酶存在于线粒体中，其活性的抑制被认为是线粒体超氧阴离子产生的可靠标记[15]，其活性的高低可以反映线粒体活性氧产生的多少。减少线粒体活性氧对机体的氧化损伤主要有两种途径，一方面是提高抗氧化系统的抗氧化能力（包括提高抗氧化酶的活性和含量，增加非酶物质的水平），清除更多的活性氧；另一方面是通过降低线粒体膜电位即解偶联的方式，减少活性氧生成。在非酒精性脂肪肝发病过程中，这两种方式可能均存在。本研究发现在模型组MnSOD酶活性及mRNA表达显著升高说明了第一个方面的存在；同时发现模型组HDMCP表达显著升高，HDMCP作为具有解偶联功能的蛋白质[5]可能通过解偶联的方式减少线粒体活性氧的生成。尽管模型组线粒体活性氧的生成增加似乎不能解释HDMCP的解偶联功能，这其实并不矛盾，因为虽然HDMCP通过解偶联的方式减少了活性氧的生成，但不足以对抗活性氧的产生，结果导致肝脏线粒体活性氧生成的增加。

前期工作证实，耐力训练可以有效地提高抗肝脏抗氧化能力，降低UCP2表达，从而改善线粒体的功能，达到预防/治疗非酒精性脂肪肝的效果[1]。然而有一些研究发现在NAFLD的动物和细胞模型中UCP2得到了表达，但其仅仅是mRNA的表达，而未检测到蛋白质的存在[3]。最近的研究表明在UCP2基因敲除鼠和正常鼠之间，其脂肪肝病变程度未见显著性差异[4]。因此，UCP2对线粒体功能有一定的影响，但起作用可能有限。进一步研究发现，UCP2在非酒精性脂肪肝发病过程中其解偶联的功能较低（UCP2相关呼吸控制确实较低，未发表），可能更为重要的是HDMCP。在非酒精性脂肪肝发病过程中，HDMCP可能作为一种应激蛋白发挥作用，通过解偶联的方式，以损失一部分能量作为代价，减少线粒体活性氧的生成。那么耐力训练对HDMCP有何影响？本研究发现经过12周的跑台运动后，肝脏HDMCP表达显著降低，其意义可能在于减少线粒体质子漏，增加线粒体ATP合成能力[16]。而氧化损伤如何解决呢？在进化的过程中机体总会以最为经济有效的方式来解决遇到的问题。HDMCP的降低可能就是一个很好的例子。本研究发现，耐力训练后，MnSOD活性、mRNA表达显著升高，说明肝脏抗氧化能力增强；同时线粒体顺乌头酸酶活性显著升高，MDA和OH·-均显著降低，说明肝脏线粒体功能改善，活性氧生成减少。在这种情况之下，肝脏细胞无需再通过解偶联的方式，以损失能量为代价，减少线粒体活性氧的生成。通过本研究认为：HDMCP在非酒精性脂肪肝发病过程中可能作为一种应激蛋白，调控线粒体活性的生成，但其调控作用不能够完全代替抗氧化系统的作用，只是起辅助作用，抗氧化系统才是真正的抗氧化主体；耐力训练后，抗氧化系统能力进一步增强，HDMCP表达降低，从而提高线粒体偶联程度，增强线粒体ATP合成能力。

4 结论

HDMCP在非酒精性脂肪肝发病过程中可能作为一种应激蛋白，调控线粒体活性的生成，但其调控作用不能够完全代替抗氧化系统的作用，只是起辅助作用，抗氧化系统才是真正的抗氧化主体；耐力训练后，抗氧化系统能力进一步增强，HDMCP表达降低，从而提高线粒体偶联程度，增强线粒体ATP合成能力。

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The Effect of Endurance Training Induced Downregulation of HDMCP on M itochondrial Reactive Oxygen Species Production in NAFLD M ice

LIU Yanhuan,MA Guodong
（School of PE,Shandong University of Technology,Zibo 255049,China）

Objective:To investigate the effect of endurance training on HDMCP expression and its impact on mitochondrial reactive oxygen species production in NAFLD.Methods:Itanalysised the expression of HDMCP and MnSOD and the changes of aconitase activity,MnSOD activity,contents of MDA and OH.-in liver in western diet-induced NAFLD of apoE knockoutmice after 12 week treadmill endurance training.Results:Western diet significantly increased expression of HDMCP and MnSOD in liver.Aconitase activity decreased significantly,however,MnSOD activity increased remarkably,and the contents of MDA and OH-augment significantly in model group.After 12 week endurance training,expression of HDMCP decreased significantly,nevertheless,expression and activity of MnSODmore significantly increased,aconitase activity restored markedly and contents of MDA and OH.-significantly lowered.Conclusion:In NAFLD,HDMCP expression increased,which enhanced the inhibition ofmitochondrial reactive oxygen species production,however, endurance training induced downregulation of HDMCP attenuated the inhibition ofmitochondrial reactive oxygen species production and increased the capability of ATP synthesis ofmitochondria.

endurance training;non-alcoholic fatty liver disease;reactive oxygen species;HCC-down-regulated mitochondrial carrier protein

G 804.2

A

1005-0000（2010）02-0154-04

2009-11-19；

2010-01-18；录用日期：2010-01-20

山东理工大学博士启动基金资助项目（项目编号：406049）

刘艳环（1971-），女，吉林白城人，山东理工大学讲师。

山东理工大学体育学院，淄博255049。