补充精氨酸对过度训练大鼠肌糖原、AMPK及GLUT-4的影响

刘无逸，陆爱云

●研究报道Short Communications

补充精氨酸对过度训练大鼠肌糖原、AMPK及GLUT-4的影响

刘无逸，陆爱云

目的：观察体外补充L－精氨酸对过度训练大鼠的作用。方法：9周龄SD雌性大鼠40只，随机分为安静对照组（A组）、大强度运动组（B组）、大强度运动服L-精氨酸组（C组）、过度训练组（D组），其中D1组为过度训练组，D2组为过度训练加服L-精氨酸组。上坡跑训练9周后测各组白腓肠肌和比目鱼肌的肌糖原含量、AMPK活性和肌膜GLUT-4含量。结果：B组和D1组糖原含量较A组有升高趋势，但无显著性；C组显著高于A组（P＜0.01）；D2组大鼠比目鱼肌糖原含量较A组显著升高（P＜0.01）；D2组较D1组升高，但未达到显著水平（P＞0.05）。B组、C组和D2组AMPK活性显著高于A组（P＜0.01）；D2组较D1组有明显增加，差异显著（P＜0.05）。B组、C组和D2组GLUT-4含量分别较A组增加100%左右，D1组增加11%；D2组较D1组增加57%。结论：体外补充L-精氨酸可能有利于延缓或治疗过度训练。

大鼠；过度训练；L-精氨酸；肌糖原；AMP-活化的蛋白激酶；葡萄糖载体蛋白-4

目前，过度训练在运动员中仍是较为常见的运动性疾病之一。研究认为，高水平运动员常在他们的职业生涯中发生过度训练，如径赛运动员发生率达60%，澳大利亚国家游泳队在半年的赛季中发生率是21%，印度国家蓝球队在6周集训期间发生率是33%，半职业的足球运动员在5个月的赛季以后发生率在50%以上。尽管过度训练的发病率较高，但产生的机制目前尚未完全明了，许多研究认为与代谢紊乱关系密切，Petibois等[1]将其称为代谢紊乱综合症（a metabolism alteration process syndrome）。

左旋精氨酸（L-arginine，L-Arg）是体内合成一氧化氮（NO）的天然底物，即L-Arg和O2在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的作用下，生成NO和瓜氨酸（L-Cit）。NO在体内具有广泛的生理作用，其中对骨骼肌葡萄糖转运具有促进作用。近年来在对心、肺、肝等脏器缺血/再灌注的研究中发现，L-Arg可明显减轻再灌注损伤[2]，同时，L-Arg也被用于烧伤、心力衰竭等多种临床疾病。本实验的目的是观察体外补充（口服）L-Arg对过度训练大鼠骨骼肌糖原含量及部分调节因素的影响，探讨过度训练发生的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象

1.1.1 大鼠分组9周龄Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠40只，由中国科学院上海实验动物中心提供，以国家标准啮齿类动物饲料（由上海海军医学研究所动物中心提供）每笼5只（鼠笼体积40 cm×27 cm×22 cm）饲养，自由进食、饮水，室温20℃～25℃，相对湿度45%～55%，每天光照时间12 h。大鼠随机分4个大组：对照组（A组），7只；大强度运动组（B组），7只；大强度运动服L-精氨酸组（C组），8只；过度训练组（D组），18只；再分D1组9只；D2组（服L-精氨酸组），9只。

1.2 主要试剂和测试方法

1.2.1 主要试剂与材料肌糖原测定试剂盒由南京建成生物研究所提供；SAMSPeptide为UPSTATE产品；[γ-32P]ATP，福瑞生物工程公司核酸研究室提供；兔抗鼠GLUT-4，Chemicon产品；辣根酶标记山羊抗兔IgG，北京中山生物技术有限公司；三磷酸腺苷（ATP），Sigma产品；Whatman P81滤纸，Whatman公司产品；L-精氨酸，上海医药集团上海化学试剂公司提供；一氧化氮测定试剂盒和一氧化氮合酶测定试剂盒，南京建成生物研究所提供。1.2.2测试方法称取肌肉组织120mg用眼科剪剪碎后，加缓冲液A（210mM蔗糖，2mMEGTA，40mM NaCl，30mM HEPES，pH 7．4，蛋白酶抑制剂）3 mL，置试管内冰水浴中用MICCRA D-8型匀浆器15 s×2次匀浆。取1 mL匀浆上清液置-78℃冰箱保存备用，其余匀浆液经超速离心提取肌膜。

肌糖原含量、肌NO含量、肌NOS活性均按南京建成生物研究所提供的试剂盒说明书操作，蛋白定量采用BCA法；肌AMP-活化的蛋白激酶（AMPK）活性的测试根据Derave等[5]方法进行；肌膜葡萄糖载体蛋白-4葡萄糖载体蛋白-4（GLUT-4）蛋白测定按Dubouchaud等[6]的方法进行。

1.3 统计方法

实验数据采用SPSS 9．0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（D）表示，计数资料用百分率表示，组间比较分别采用单因素方差分析。显著性标准为P＜0．05，P＜0．01为差异具有高度显著性。

2 结果

2.1 训练期间大鼠的体重变化

9周训练后，D1和D2组大鼠毛发耸立无光泽，活动减少，反应迟缓，后期不能完成120min的运动时间；但体重与其他各组比较差异均无显著性（P＞0．05）（见图1）。

图1 大鼠训练期间体重变化Figure 1 Changes in rats body weightduring breeding

2.2 各组大鼠肌糖原含量

大鼠在9周运动训练后比目鱼肌安静肌糖原含量有明显的升高（见表2），与A组比较C组和D2组达到显著和非常显著水平（P＜0．05；P＜0．01）；D2组与D1组比较糖原含量虽有升高，但尚未达到显著水平。

9周训练后白腓肠肌糖原含量有增加趋势，其中C组与A组比较有非常显著的差异，P＜0．01（见表2）；D2组与D1组比较糖原含量虽有升高，但未达到显著水平。

表2 各组大鼠肌糖原含量（m g/g肌组织）Table 2 Themusc le glycogen contents in various groups（mg/g wetm uscle）

2.3 各组大鼠肌AMPK活性

9周耐力训练后，大鼠比目鱼肌AMPK活性有升高的趋势，B组与A组比较差异具有显著性（P＜0．05）。D1组肌AMPK活性与B组比较肌AMPK活性下降的差异非常显著（P＜0．01）。D2组肌AMPK活性较D1组提高，差异显著（P＜0．05）（见表3）。

在大鼠白腓肠肌，AMPK活性B组、C组和D2组均较A组增加，差异均非常显著（P＜0．01）。D1组与B组比较，活性下降具有非常显著意义（P＜0．01）；D2组与D1组比较，活性明显增加，差异非常显著（P＜0．01）。腓肠肌AMPK活性D2组较D1组提高，具有非常显著的差异（P＜0．01）（见表3）。

2.4 各组大鼠比目鱼肌肌膜GLUT-4蛋白含量

各组比目鱼肌肌膜GLUT-4蛋白质印迹试验结果见图2（S为参照样本的膜蛋白）。用Image-pro plus分析软件对各条带的分析结果见表4。

9周耐力训练使B组、C组、D1组和D2组大鼠比目鱼肌肌膜GLUT-4蛋白积分光密度分别较A组增加115%、92%、11%和75%；D1组GLUT-4蛋白积分光密度较B组下降48%，D2组下降19%；D2组与D1组比较GLUT-4蛋白积分光密度增加了57%。

表3 各组AMPK活性（nm ol·m in-1·mg-1 prot）Table 3 Muscle AMPKactivity in variousg loups（nmol·m in-1·mg-1 pro）

图2 各组比目鱼肌GLUT-4蛋白含量（S为参照）Figure 2 sarcolemma GLUT4 protein contens in soleus

表4 各组比目鱼肌GLUT-4蛋白含量比较Table 4 sa rcolemma GLUT4 protein contens in soleus

2.5 各组大鼠肌NOS活性

经9周耐力训练，B组和C组比目鱼肌和白腓肠肌NOS活性较A组有一定提高（见表5），但均未达到统计学意义；D1组和D2组较B组降低，具有显著性（P＜0．05）；D2组与D1组之间无显著性差异（P＞0．05）。

表5 各组肌NOS活性（U/mg prot）Table 5 Musc le NOS activity in various gloups（U／mg prot）

2.6 各组大鼠肌NO含量

9周耐力训练后B组和C组大鼠比目鱼肌NO含量略有升高，但无统计学意义（见表6）；D1组和D2组比目鱼肌NO含量基本维持在A组水平。在白腓肠肌，B组和C组肌NO含量较A组升高，差异均非常显著，P＜0．01；D1组和D2组肌NO含量分别较B组和C组降低，D1组差异具有显著性，P＜0．05。

3 讨论

L-Arg被认为是免疫营养成分之一，在体内可通过NO合成途径和诱导生长激素、胰岛素及高血糖素等作用于免疫系统的途径发挥生理作用[7]，被用于严重的创伤、感染和应激等。

过度训练是运动员在运动训练中较容易出现的一种运动性疾病，是长期应激状态下的一种病理状态，主要表现为身体机能低下，其产生的机制较为复杂，Petibois等[1]将其称之谓代谢紊乱综合症，其依据之一认为过度训练与肌糖原耗竭有关[8]。我们将L-Arg用于过度训练大鼠，观察对肌糖原含量及部分调节因素可能产生的影响。

表6 各组肌NO含量（um ol/g pro t）Table 6 Musc le NO contents in various gloups（umol/g p rot）

实验中我们发现补充L-Arg可提高正常训练大鼠和过度训练大鼠肌糖原的含量，比目鱼肌的表现尤为明显，机制可能与NO可促进骨骼肌葡萄糖转运有关。肌细胞对葡萄糖的转运有两条途径，即胰岛素依赖途径和非胰岛素依赖途径。据Balon和Nadler[9]的实验发现，L-Arg可引起趾长伸肌NO浓度升高，增加大鼠骨骼肌基础葡萄糖转运。L-Arg的这种作用可被L-NG-甲基精氨酸（L-NMMA，NOS的阻断剂）抑制，且不受胰岛素浓度的影响，表明NOS/NO参与骨骼肌葡萄糖代谢是通过非胰岛素依赖的途径进行的[10-11]。

长期耐力运动可促进NOS活性的提高[12]，增加NO的合成，但我们发现在过度训练状态下，大鼠肌NOS活性较正常训练组显著下降，其值甚至低于安静对照组的水平。补充L-Arg对其活性无激活作用，显示在过度训练状态下，NOS的活性受到抑制。

正常情况下，NOS的活性受AMP-活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的调节。近年来的研究表明，AMPK能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡。当细胞ATP减少时，AMPK一方面抑制糖原、脂肪和胆固醇合成，减少能量消耗；另一方面促进脂肪酸氧化、葡萄糖转运，增加能量的产生。因此，被认为是调节细胞能量代谢的开关[13]。

实验显示过度训练大鼠肌AMPK活性与正常训练组比较受到明显抑制，补充L-Arg可显著提高肌AMPK的活性，显示L-Arg对肌AMPK活性具有一定的保护作用，但这一现象从肌收缩促进葡萄糖转运增加的信号链角度很难解释。

Fryer等学者认为[14]AMPK可通过NOS依赖的途径促进骨骼肌的葡萄糖摄取。他们发现NOS活性随着葡萄糖转运而增加，NOS抑制剂可阻断AMPK活化引起的葡萄糖转运作用。在体外，nNOS和eNOS能被AMPK磷酸化，其产物NO可激活鸟苷酸环化酶，然后催化cGMP的合成。用鸟苷酸环化酶抑制剂可防止这些细胞由AICAR（5-Am inoim idazole-4-carboxam ide 1-β-D-ribofuranoside，为AMPK刺激剂）刺激引起的葡萄糖转运。这些结果表明AMPK在诱导葡萄糖转运方面，NOS是重要因素之一。目前认为这一信号链由肌收缩发动，随着肌组织中AMP含量增加使AMPK活化，后者可引起NOS磷酸化（活化），增加NO的合成，NO进一步活化鸟氨酸环化酶，加快cGMP形成，促进细胞内GLUT-4向肌膜转位，提高葡萄糖的转运[15]。可见，NO位于AMPK的下游，对AMPK不产生直接的作用，最大的可能是通过间接的途径减轻AMPK抑制因子对AMPK活性的抑制，提高AMPK的活性。如通过cGMP对AMPK产生一定的调节作用。

尽管长期耐力训练可提高NOS活性，过度训练状态下，NOS活性受到抑制，但实验中补充L-Arg对正常训练大鼠或过度训练大鼠比目鱼肌和白腓肠肌的NO含量无显著性的改变。这可能与NO分子在体内半衰期短（约5 s左右）、作用迅速，我们采用的分析方法不够灵敏有关。

肌细胞摄取葡萄糖需葡萄糖转运蛋白（GLUT）作为载体，其中载体蛋白4（Glucose transporter type 4，GLUT-4）是骨骼肌葡萄糖跨膜转运的主要载体，葡萄糖转运被认为是肌细胞葡萄糖代谢的限速步骤。安静时，GLUT-4主要分布在细胞内的管泡状结构（TGN区）内，当受到胰岛素或肌收缩刺激时，可向胞膜和T管转移，增加肌膜表面GLTU-4的含量。

我们在实验中发现过度训练大鼠肌膜GLUT-4含量较正常训练组减少48%，补充L-Arg可使过度训练大鼠肌膜GLUT-4含量增加57%，但在正常训练组大鼠这一作用不明显。前者可能因为过度训练时，AMPK的活性受到抑制，对NOS的活化作用减弱。补充外源性L-Arg，增加了NOS的作用底物，有利于NO的产生，促进细胞内GLUT-4向肌膜转位，提高胞膜的GLUT-4含量。后者可能由于肌AMPK、NOS活性正常，增加底物对进一步提高NO的意义不大。因此，在正常训练状态下，补充外源性L-Arg对提高肌膜GLUT-4含量的作用不明显。

过度训练产生的机制复杂，肌细胞能量代谢障碍可能是重要因素之一。从肌细胞对葡萄糖转运角度出发，过度训练状态下虽然肌AMPK活性、NOS活性受到抑制，肌膜GLUT-4含量降低，但糖原含量基本正常。补充L-Arg可在一定程度上改善AMPK的活性，提高肌膜GLUT-4含量，增加肌糖原的含量，可能有利于延缓或治疗过度训练。实验显示过度训练在肌糖原含量基本正常情况下仍可发生，可能提示肌细胞对糖利用的障碍，值得进一步研究。

4 结论

体外补充L-精氨酸可增加过度训练大鼠肌糖原的含量，并可提高肌AMPK活性，增加肌膜GLUT-4含量，可能有利于延缓或治疗过度训练。

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Effect of Supp lying L-arginine on Skeletal M uscle G lycogen,AMPK Activity and Sarcolemm a GLUT4 Protein Contentsin Overtraining Rats

LIUWuyi,LU Aiyun
（School of Sport＆Exercise Science,ShanghaiUniversity of Sport,Shanghai200438,China）

Objective:The purpose of the present study was to observe effect of supplying L-arginine on skeletalmuscle glycogen contents,AMP-activated protein kinase(AMPK)activity and sarcolemma Glucose transporter type 4(GLUT4)protein contents in overtraining rats．Methods:Forty SD ratswere randomly divided into group A(sedentary),group B(underwentendurance exercise 60minutes/day),group C(underwentendurance exercise 60minutes/day, supplying L-arginine)and group D(underwentendurance exercise 120minutes/day),group D subdivided group D1(without L-arginine)and group D2(with L-arginine)．All exercise groups were trained 6 days/wk for 9 weeks．Muscle glycogen,sarcolemma GLUT4 contents and muscle AMPK activity were determined after the 9-week training．Results:Muscle glycogen contents in group B and group D1 exist a trend of increase compared with that in group A,but not significantly(P＞0．05)．Muscle glycogen contents in soleus showed a significant higher level in group C and group D2 compared with that in group A(P＜0．01), and itshowed a trend of increase in group D2 compared with that in group D1,but not significantly(P＞0．05)．Muscle AMPK activity in group B,group C and group D2 increased significantly compared with that in group A,and it showed a significanthigher level in group D2 compared with that in group D1(P＜0．01)．Sarcolemma GLUT4 contents in group B,group C and group D2 increased about 100%compared with that in group A,but it only increased 11%in group D1．And that increased by 57%in group D2 as compared with that in group D1．Conclusion:Supplying with L-Arg could increase muscle glycogen cotents, muscle AMPK activity,and sarcolemma GLUT4 content in overtraining rats,whichmightbe helpful in staying or treating overtraining．

rat;overtraining;L-arginine;muscle glycogen;GLUT4;AMPK

G 804．7

A

1005-0000（2010）04-0340-04

2010-04-20；

2010-05-12；录用日期：2010-05-15

上海市教委课题（项目编号：06IZ004）；上海市重点学科建设项目（项目编号：S30802）

刘无逸（1955-），男，浙江宁波人，上海体育学院副教授。

上海体育学院运动科学学院，上海200438。

从第7周开始，配制浓度为1%的L-精氨酸溶液供C组和D2组大鼠每晚饮用（溶液量略多于给药前3个晚上的最大饮水量），连续3周。

1.1.2 大鼠训练方案购入大鼠经一周适应后，参照Bedford等的大鼠运动负荷标准[3]，采用BCPF-98型生物医学动物跑台（由杭州立泰科技有限公司提供）进行上坡跑训练。训练时间为9周，其中前4周为递增负荷，后5周维持大强度运动，每周训练6天。

大鼠过度训练模型根据叶剑飞等[4]采用的方法适当改进后进行，具体方案见表1。

表1 9周大鼠训练方案
Table 1 9-week train ing pro tocol for rats

训练周次/（m·min-1）坡度/%时间/（m·min-1）速度/（m·min-1）坡度/%时间/（m·min-1）1 15 0 30 15 0 30 2 20 5 45 20 5 60 3 25 10 45 25 10 90 4 30 15 45 30 15 90 5 30 15 60 30 15 120 6 31 15 60 31 15 120 7 32 15 60 32 15 120 8 33 15 60 33 15 120 9 35 15 60 35 15 120 B组和C组D组速度

1.1.3 大鼠处死和取材9周训练结束后36 h，各组大鼠于安静状态下断头处死，均取比目鱼肌和腓肠肌白肌部分，液氮速冻后置-78℃冰箱保存备用。