桑叶黄酮类和多糖类化合物的提取及其降血糖作用研究

寇秀颖 杜阳吉 徐 勇

（广东省食品工业研究所，广东省食品工业公共实验室，广州 510308）

·基础研究·

桑叶黄酮类和多糖类化合物的提取及其降血糖作用研究

寇秀颖*杜阳吉 徐 勇

（广东省食品工业研究所，广东省食品工业公共实验室，广州 510308）

从桑叶中提取总黄酮和多糖，并测定其对α-葡萄糖苷酶和猪胰液α-淀粉酶的抑制作用以评估其降血糖功能。结果表明，桑叶中提取的黄酮类和多糖类化合物对这两种酶都有较好的抑制作用，并且总黄酮和多糖对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶的抑制存在协同作用，两者混合对两种酶的抑制作用更强。

桑叶；黄酮；多糖；降血糖作用；协同作用

桑叶为桑科桑属植物桑M orus alba L.的干燥叶。桑叶始载于《神农本草经》，桑叶性寒、味甘苦，是中医清热解毒之要药。主治风热感冒，肺热燥咳，头晕头疼，目赤晕花等症。已有研究表明，桑叶的降血糖效果较为显著，但是对其降血糖有效成分的确认一直存在争议，有观点认为其降血糖有效成分是黄酮类化合物或多糖类化合物，也有学者认为是生物碱类化合物。为了更有效地开发和利用桑叶这种天然产物在治疗糖尿病方面的药用价值，本实验对桑叶中黄酮类化合物和多糖类化合物的提取和纯化进行了研究，并对其降血糖功能进行了测定。本研究为桑叶在糖尿病的临床治疗方面提供了可靠的实验数据和理论基础，也将促进桑叶在功能食品中的开发和利用。

1 实验试剂与仪器

1.1 原料与试剂

桑叶，广东韶关；Diaion HP-20大孔树脂，日本三菱公司；葡萄糖及蔗糖，AR级，广州化学试剂厂；MECK碱性氧化铝固相萃取柱，German；各种型号的层析柱；α-葡萄糖苷酶、猪胰液α-淀粉酶以及蓝淀粉，Sigma。

1.2 仪器

UV－6300PC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；5415D离心机，Eppendorf公司；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣仪器设备厂；DK-8D型电热恒温水槽，上海精密实验设备有限公司；BSZ-100自动部分收集器，上海青浦沪西仪器厂。

2 桑叶多糖的提取及含量测定

2.1 桑叶多醣含量测定方法

按照参考文献［6］和［7］的方法，以吸光度D（λ）为纵坐标，糖质量浓度ρ为横坐标，得到回归方程：D （λ） =0.053 7ρ+0.035 6，R=0.997 9。表明在质量浓度为1.0 mg/L～10 mg/L具有良好线性关系。

2.2桑叶多糖的提取及纯化

称取100 g桑叶粉末，按1∶30的料液质量比加入去离子水，在80℃恒温下回流提取3 h，重复3次。最后过滤提取液，重复10次，合并滤液后进行浓缩精制。

将3 LDiaion HP-20大孔树脂装填于层析柱中，将全部提取液加水稀释至5 L，用恒流泵缓慢上样，流速约为0.05 mL/s，用H2O-乙醇体系洗脱（乙醇体积浓度分别为0%、10%、30%、50%、70%、100%）。收集0%～50%组分，合并，浓缩干燥，得到纯化后的桑叶多糖8.36 g。其含量测定按2.1方法进行，结果表明桑叶多糖纯度为75.69 g/100 g。

将上述纯化的桑叶多糖用10倍质量的水溶解，加入多糖溶液1/5体积的氯仿和氯仿1/5体积的正丁醇，搅拌30 min，离心，弃去下层和中间层变性蛋白，上层清液用去离子水补足体积，如此反复5次，真空浓缩，除去有机溶剂，加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，离心。收集沉淀，用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀，真空干燥得到精制的淡黄色多糖3.65 g。其含量测定按2.1方法进行，结果表明桑叶多糖纯度为90.34 g/100 g。所得多糖用于活性测定。

3 桑叶黄酮类化合物的提取及含量测定

3.1 总黄酮含量测定方法

称取芦丁标准品20 mg，加体积浓度60%乙醇溶解，定容，得标准液(含无水芦丁0.2 g/L)。分别量取芦丁标准液0 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL到25 mL容量瓶中，用体积浓度60%乙醇定容至6 mL，加入50 g/L亚硝酸钠溶液0.75 mL，摇匀，静置6 min；再加100 g/L硝酸铝溶液0.75 mL，摇匀，静置6 min；再加40 g/L氢氧化钠溶液10 mL，用体积浓度60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置10 min，于500 nm测溶液吸光度。以质量浓度ρ为横坐标，吸光度D（λ）为纵坐标，得回归方程：D（λ） =8.475 6×ρ-0.057 3，R=0.999 8。

3.2 桑叶黄酮类化合物的提取

称取100 g桑叶粉末，用体积浓度75%乙醇回流提取3次，每次4 h，重复10次。减压浓缩初提液得到灰黑色浸膏。用适量的水溶解浸膏，依次用二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取，各部分提取液减压浓缩干燥。

对乙酸乙酯提取物进行硅胶柱层析，用不同体积浓度石油醚乙酸乙酯溶液进行梯度洗脱，通过TLC检测，将70%～100%部分合并，蒸干待用。

对正丁醇部分先用大孔树脂Diaion HP-20进行初分，以不同体积浓度甲醇作为洗脱剂，除去正丁醇部分中水溶性的盐分及多糖类，弃去10%～50%部分，合并70%～100%部分，蒸干待用。

将上述几部分提取物继续用大孔树脂Diaion HP-20进行纯化，以不同体积浓度甲醇作为洗脱剂，合并40%～100%部分，蒸干得到10.32 g黄棕色固体，测定该部分总黄酮含纯度92.42 g/100 g，所得总黄酮用于活性测定。

4 桑叶黄酮类和多糖类化合物降血糖作用研究

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂能够使碳水化合物的消化过程延长在整个小肠进行。由于消化时间的延长，单糖被肠黏膜的吸收缓慢，使餐后血糖升高的幅度降低。如果能够抑制人体内消化系统存在的碳水化合物水解酶即α-葡萄糖苷酶（麦芽糖酶与蔗糖酶）的活性，便可以抑制餐后血糖水平的上升。因此，我们通过测定桑叶黄酮类和多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶（麦芽糖酶与蔗糖酶）与猪胰液α-淀粉酶的抑制作用来评价其降血糖功能。

4.1 对α-葡萄糖苷酶抑制作用的测定方法

a） 准确量取200 μL的蔗糖或麦芽糖溶液，200 μL pH为7的磷酸钾缓冲液和100 μL待测物溶液制成底物溶液；

b） 向底物溶液加入400 μL α-葡萄糖苷酶溶液，充分混合；

c）将测试样和空白样一起放入恒温槽于37℃下恒温15 min；

d） 分别加入800 μL2 mol/L的TRIS-HCl缓冲液终止反应；

e）将反应混合物通过碱性氧化铝小柱以除去一些酚类物质和酸性物质；

f）将1 mL的萃取液和4 mL的酚酶试剂充分混合，于37℃恒温30 min；

g）于490 nm下测定测试样和空白样的吸光度D（λ） 值；

h） 计算其抑制率：抑制率（%）=（D（λ）空白－D空白（λ）待测物）/D（λ）空白×100。

4.2 对猪胰液α-淀粉酶抑制作用的测定方法

a） 准确量取 0.5 mol/L pH为 6.9 Tris-HCl（CaCl2）缓冲液3mL于EP管中；

b） 准确称取8 mg蓝淀粉，并将其悬浮在Tris-HCl（CaCl2）缓冲液中制得蓝淀粉悬浮液；

c）将蓝淀粉悬浮液于沸水浴恒温5 min，然后在37℃恒温5 min；

d） 将0.2 mL待测物溶液（空白样用0.2 mL Tris-HCl溶液代替待测物溶液）和0.2 mL PPA溶液加入到蓝淀粉溶液中，混合均匀；

e） 将测试样和空白样于37℃下恒温10 min，将0.1 mL的乙酸溶液加入测试样和空白样终止反应；

f）将反应混合物离心5 min，取上清液待测；

g） 在595 nm下测定测试样和空白样的吸光度；

h） 计算抑制率：抑制率（%） =（D（λ）空白－D （λ）待测物）/D（λ）空白×100。

4.3 桑叶黄酮类和多糖对α-葡萄糖苷酶及α-

淀粉酶抑制作用的测定

桑叶黄酮类和多糖类化合物及两种化合物混合后对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶抑制作用的测定结果见表1。

表1 抑制作用测定结果

从表1可以看出，桑叶黄酮类和多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶均有抑制作用，而当二者混合后对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶的抑制作用显著高于黄酮类和多糖类化合物单独作用时的抑制作用，说明二者结合使用在降血糖方面具有协同作用。

5 结果与讨论

a）本文研究了从桑叶中提取纯化黄酮类和多糖类化合物的方法，并测定了其纯度。

b）本文测定了桑叶中提取的黄酮类和多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶的抑制作用，结果表明黄酮类和多糖类化合物对两种酶的抑制作用很高，都可能是桑叶中降血糖的主要成分。

c）本文测定了桑叶黄酮类和多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶抑制活性的协同作用。结果表明，桑叶黄酮类和多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶及猪胰液α-淀粉酶的抑制作用存在明显的协同作用，两者混合的抑制作用更强。我们初步认为桑叶的降血糖作用可能是多种有效成分共同作用的结果，但其协同作用的机理还有待进一步研究。

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Study on antidiabetic offect of flavoinds and polysacchrides from the mulberry leaves

KOUXiu-ying*DUYang-jiXUYong
（Guangdong food industryinstitute，Guangdong provincial food industrypublic laboratory，Guangzhou 510308，China）

The crude flavonoids and polysacchrides were extracted and purified from the mulberry leaves.In order to masure their antidiabetic effect，the enzyme inhibitory effect against rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase of the flavonoids and polysacchrides were studied.The result revealed the flavonoids and polysacchrides demonstrated significant enzyme inhibitory.In addition，the isolated flavonoids and polysacchrides showed synergistic inhibitory capacity to rat intestinal α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase， and the inhibitory effect of flavonoids and polysacchrides was improved significantly.

mulberry leaves； flavoinds； polysacchrides；antidiabetic effect；synergistic effect

*寇秀颖，女，1979年出生，2010年毕业于东北农业大学，食品科学专业，博士，工程师。

2010-09-16