iNOS 在大鼠性成熟期睾丸组织的表达变化及意义

任亚萍 孙 莉 毛庭枝 邵晓云 陈 筠 农林琳

摘要: 目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在雄性SD大鼠性成熟期睾丸中的表达变 化情况及意义。 方法:选取出生后5周､7周和10周的雄性SD大鼠各6只,左侧睾丸行石蜡切 片,运用免疫组化ABC法观察iNOS在雄性SD大鼠性成熟期睾丸中的表达变化情况。 结果:①出生后5周,iNOS睾丸间质细胞阴性表达。②出生后7周,绝大部分生精小管断面有精子发生 ,iNOS睾丸间质细胞弱阳性表达,精母细胞阳性表达。③出生后10周,iNOS睾丸间质细胞 强阳性表达,精母细胞阳性表达。结论:在雄性SD大鼠的睾丸间质细胞中,随着性成熟发育iNOS的表达渐强。

关键词:一氧化氮合酶;睾丸;大鼠;性成熟

中图分类号: Q959.837;Q954.6;Q954.592 文献标识码: A 文章编号: 1008-2409(2009)05-0841-03

The expression and significance of the iNOS in the sexual-maturity SD rats te stis/REN Ya-ping, SHUN Li, MAO Tin-zhi, et al.∥Depatment of Histology and Emb ryology, Guilin Medical College, Guilin 541004, China

Abstract:Objective: To explore the expression and significance of the inducible nitric ox ide synthase (iNOS) in the sexual-maturity male SD rats testis.Met h ods: Eighteen male SD rats born for 5 weeks, 7 weeks and 10 weeks were selectedw ith each 6 rats. Paraffin sections of the left testis were made and the expressi on of the iNOS in the testis of male SD rat was observed by immunohistochemicalABC method.Results: iNOS was expressed in Leydig cells of the testis, and thep ositive degree were(-), (++) and (+++) respectively in the 5-w, 7-w and 1 0 -w groups. iNOS was also expressed in some spermatocytes. Conclusion: With the d e velopment process of sexual maturation, positive expression of iNOS shows the tr end of increasing in the Leydig cells of sexual-maturity male SD rat.

Key words:iNOS; testis; SD rat; sexual maturity

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)作为体内一种重要的第二信使,广泛分布于雄性生殖系 统的各组织细胞内,其作用及机制的研究已取得很大进展[1]。由于NO半衰期极短 ,一般主 要通过测定一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)的活性来认识它。笔者已对内皮 型NOS(eNOS)细胞色素P450(芳香化酶)在性成熟大鼠睾丸中的分布进行了研究,本实 验以雄性SD大鼠为研究对象,采用免疫组化ABC染色法,显示诱导型NOS(iNOS)在 性成熟期前后的雄性SD大鼠睾丸间质中表达的变化规律,为NO与人类生殖发育及相关病症关 系的研究提供形态学依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

一抗:兔抗大鼠iNOS(诱导型一氧化氮合酶);二抗:生物素化山羊抗兔 IgG(北京博奥森生物工程有限公司提供)。

1.2 实验动物及标本制备

选用出生后21d雄性SD大鼠18只(本院动物中心提供,SPF级) ,室外喂养两周,于生后5周､7周和10周各取6只,麻醉后取材,置睾丸于中性福尔马林液( 甲醛浓度为36%)中固定,石蜡包埋,制成6μm厚的连续切片。1.3 方法

运用热修复抗原程序:石蜡切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡,蒸馏水洗3次; 用0 .01 mol/L枸橼酸盐缓冲液电炉修复5~10 min,滴加抗原修复液I 5~10 min,0.1 mol/L (pH 7.4)PBS洗2~3次,每次2 min;滴加正常山羊血清封闭液20 min,甩去多余液体不洗,加稀 释的一抗(1∶100)4℃过夜,0.1 mol/L (pH7.4)PBS洗3次,每次2 min,滴加生物素化山 羊 抗兔IgG室温20 min,0.1 mol/L PBS洗3次,每次2 min,滴加试剂SABC,室温20 min,0.1 mo l/L PBS 洗4次,每次5 min 。DAB显色5~10 min。阴性对照用PBS代替一抗。

1.4 结果判断

阳性表达的细胞胞质被染成棕黄色,阴性表达的细胞胞质不显色。结果判 定按染色细胞的数量比(阳性/总体)和染色深度进行半定量测定,染色细胞数量以每只大 鼠取3张切片,每张切片随机取5个视野,计数每5个生精小管间的阳性间质细胞数与本视野 所有间质细胞数之比。染色细胞的数量记分规则:无着色细胞为0分;着色细胞少于整个组 织细胞数的1/3为1分;着色细胞数介于整个组织细胞数的1/3~2/3为2分;着色细胞数超 过整个细胞数的2/3为3分。细胞染色深度按颜色深浅记分为:0分,1分,2分,3分。判定 结果:二者相加除以2,0分阴性(-),0~1分弱阳性(+),1~2分阳性(),2~3分强阳性() 。

2 结果

2.1 出生后5周免疫反应表达情况

偶见生精小管断面有精子发生,iNOS睾丸间质细胞阴性表达。

2.2 出生后7周免疫反应表达情况

绝大部分生精小管断面有精子发生, iNOS睾丸间质细胞弱阳性表达,部分精母细胞阳 性表达。

2.3 出生后10周免疫反应表达情况

iNOS睾丸间质细胞强阳性表达,部分精母细胞阳性表达。

2.4 iNOS的免疫组化结果

出生后5,7,10周的大鼠睾丸组织iNOS的免疫组化结果见图1。

3 讨论

雄性SD大鼠性成熟时间为出生后7~8周,本实验所取材动物睾丸是出生后5,7和10周, 代表了雄性SD大鼠性成熟睾丸发育的重要阶段。

本课题组早前的研究得知,出生后5周､7周和10周,相应的睾丸间质 细胞胞质eNOS免疫反应阳性,阳性程度为(､+和)。而本次实验的结果为随着性成熟 发育 iNOS在睾丸间质细胞中的表达为(-､泛同)。eNOS 和iNOS同作为NO合成限速酶 ,在生长发育的同一阶段呈现出不同的表达,结合莘晓陶等[2]的研究, eNOS和iN 0S在牵 张成骨过程中互相制约对骨形成和骨改建起非常重要的调解作用,同理,睾丸组织中所表达 的eNOS和iNOS在雄激素的合成过程和生精细胞的增殖活动中也相互协调,保证NO水平维持在 合适的浓度,进而调控激素水平､引导细胞增殖或凋亡。

有学者[3,4]在研究静脉曲张大鼠睾丸组织中iNOS的表达时,指出iNOS过度表达是 导致不育的原因之一,主要影响了生精小管细胞的增殖过程,故iNOS表达与细胞增殖有关。 iN OS在胃癌､结肠癌组织中的发生､发展中也起重要作用[5],iNOS表达可促进癌细 胞增殖。 国内学者[6,7]认为一氧化氮具有促使生殖细胞凋亡的作用,而iNOS表达增加 可能是影 响细胞凋亡的重要因素。另有学者[8]指出iNOS的信使RNA(mRNA)在巨噬细胞的 高表达, 说明睾丸内源性NO的大量产生与巨噬细胞iNOS活性增高有关。而在男性不育的研究[9 ]中认 为iNOS的高表达与肥大细胞指数相关。随着大鼠生长发育其免疫机制也趋完善,巨噬细胞､ 肥大细胞参与免疫活动的能力也渐增强,本实验结果显示随着性成熟发育 iNOS的表达渐强 ,这正与前人研究[8,9]相吻合。

本实验中发现,iNOS在接近成熟期的精母细胞中有表达,推测NO参与了初级精母细胞向次级 精母细胞的转化过程,亦或是精母细胞步入凋亡的标志。但对其意义的研究还需进一步展开 ,此将为后续实验指明方向。

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(收稿日期: 2009-07-15)

[责任编辑 王慧瑾 邓德灵]